魚腐乳前發酵過程中蛋白質的降解及工藝的優化

沈會玲，曾 磊，江 鋒，周常義，蘇國成*

（1.集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.廈門中集信檢測技術有限公司，福建 廈門 361021）

近幾年來隨著漁業的發展，魚糜制品的產量也逐年提升，深受消費者的青睞，具有廣闊的市場前景。發酵魚糜制品主要是指在魚糜中加入微生物，經發酵作用使魚糜的蛋白質、脂肪或碳水化合物發生不同變化，形成其特有的風味與口感的食品。

隨著對發酵魚糜制品的深入研究，學者們不斷探索利用不同菌種與發酵方式提高發酵魚糜的質量[1-2]。KASANKALA L等[3]研究了豆豉發酵劑對發酵魚醬的營養價值的影響，發現經過豆豉發酵劑發酵的魚糜營養成分及活性物質都顯著提高。趙培城等[4]采用紹興腐乳毛霉對低值海產魚糜固態發酵，制成與豆腐乳形態相似、口感細膩的魚糜腐乳；王乃富等[5]用紅曲霉對鳙魚肉糜進行發酵，經過發酵魚糜的色澤和營養價值都得到改善，同時增強了魚糜的生物活性；周緒霞等[6]在用真菌發酵前先對魚糜進行蒸汽加熱20 min，形成凝膠后進行固態發酵。

本研究利用總狀毛霉和紅曲霉F1對魚豆腐進行發酵研制魚腐乳，采用響應面法優化魚腐乳前期發酵工藝，并對發酵過程中魚腐乳的蛋白質降解、質構和色澤的變化進行分析，旨在為開發魚腐乳產品提供理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FA級魚糜：福建晉江閩南水產開發有限公司；總狀毛霉（Mucor racemosus）：百惠生物科技有限公司。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、福林試劑、鹽酸、三氯乙酸、碳酸鈉（均為分析純）：國藥集團；酪蛋白標準品（純度99.8%）、L-酪氨酸標準品（純度99%）；食鹽、淀粉、均為市售食品級。

1.2 儀器與設備

MiniP-4電泳儀：北京凱元信瑞儀器有限公司；3-30 K冷凍離心機：德國SIGMA公司；FD-1-50真空冷凍干燥器：北京博醫康儀器公司；UV-2000紫外分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：北京國華科技集團有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 魚腐乳白坯的制作

冷凍魚糜在4℃冰箱解凍后，將水分調整為80%，空擂5 min，加入魚漿質量3%的NaCl后再鹽擂10 min，加入10%玉米淀粉，繼續擂潰10 min，將擂潰好的樣品裝入方形鋼圈，兩端密封，采用二段式加熱的方式對魚糜進行加熱，低溫加熱成型（45℃、1 h），高溫加熱（95℃、20 min）。然后用冰水迅速冷卻，放入冰箱平衡24 h備用。

1.3.2 魚腐乳發酵工藝

參照馬立安等[7]制作腐乳毛坯的方法，將制備好的魚豆腐均勻的擺放在經紫外消毒后的塑料盒內，中間留有空隙，將配制好的5×107個/mL毛霉菌菌懸液以5.3%的接種量均勻的噴灑在魚豆腐的表面，置于27℃恒溫培養箱內培養，每隔1 d取樣備用。

1.3.3 蛋白酶的提取及活性測定

將取出的樣品置于-70℃條件下預凍12 h，真空冷凍干燥處理后粉碎機粉碎，過60目篩，置于干燥器中儲存，備用。稱取1 g樣品于離心管中，加入10 mL磷酸鹽緩沖液，混勻，40℃水浴超聲提取1 h，再經冷凍離心機8 000 r/min離心10 min，取上清液進行分析檢測。蛋白酶活力的測定方法參照國標GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[8]。蛋白酶活力定義是指在一定的溫度或pH條件下，1g樣品每分鐘催化水解酪蛋白所產生的酪氨酸的微克數為一個酶活力單位（U/g）。

1.3.4 魚腐乳發酵過程中氨基酸態氮含量的測定

參照GB/T 5009.235—2016[9《]食品中氨基酸態氮的測定》中的方法進行測定。

1.3.5 魚豆腐前發酵過程中蛋白質降解的分析

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析前發酵過程中質構變化的研究，配制10%的分離膠，5%的濃縮膠，將樣品最終蛋白質量濃度調節為2 mg/mL，上樣量為10 μL，R250考馬斯亮藍染色12 h，脫色4 h。

1.3.6 魚腐乳前發酵工藝優化單因素試驗及響應面試驗

（1）單因素試驗

將濃度為5×107個/mL菌懸液以5%的接種量噴灑于魚豆腐表面，置于27℃培養箱，發酵時間分別為48 h、72 h、96 h、120 h、144 h，將濃度為5×107個/mL菌懸液以5%的接種量噴灑于魚豆腐表面，分別置于23℃、25℃、27℃、29℃、31℃，將濃度為5×107個/mL菌懸液分別以3%、4%、5%、6%、7%的接種量噴灑于魚豆腐表面，置于27℃培養箱，培養96 h。按1.3.2工藝流程制作魚腐乳毛坯，分別考察發酵時間、發酵溫度、菌懸液接種量對魚腐乳前期發酵蛋白酶活的影響。

（2）響應面試驗

對發酵前期條件進行優化，以發酵時間（A）、發酵溫度（B）、霉菌菌懸液的接種量（C）為試驗因素，蛋白酶活力（Y）為評價指標進行響應面試驗，因素與水平如表1所示。

表1 發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methododogy for fermentation conditions optimization

2 結果與分析

2.1 魚腐乳前發酵過程中氨基酸態氮含量的變化

氨基酸態氮可以快速檢測食品中蛋白質的水解程度[10]，主要包括氨基酸、水溶性蛋白以及多肽類物質，對產品的風味有一定的影響。從圖1可以看出，在前期發酵過程中，氨基酸態氮的含量呈明顯升高的趨勢，在魚豆腐白坯中，氨基酸態氮含量較低，含量僅為0.01%，而在前期發酵至第4天時，氨基酸態氮含量上升至0.23%，說明在前期發酵的過程中蛋白質發生降解，毛霉在生長代謝的過程中產生了大量的蛋白酶，而且有研究發現，毛霉分泌的蛋白酶大多數為酸性蛋白酶[11]，對于酸性物質的測定中發現，前期發酵過程中酸度逐漸升高，有利于蛋白酶活性的提升，蛋白酶會作用于大分子蛋白，蛋白質被逐漸降解為小分子肽和氨基酸。

圖1 魚腐乳前發酵過程中氨基酸態氮含量的變化Fig.1 Changes of amino acid nitrogen content of fish sufu during pre-fermentation

2.2 魚豆腐發酵過程中蛋白質降解的電泳分析

魚腐乳前期發酵過程中SDS-PAGE電泳圖結果見圖2。由圖2可知，在魚糜和魚腐乳白坯中可以清楚的看到很多大分子蛋白的條帶，而在發酵至第48小時，肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）和肌動蛋白（actin）等大分子條帶明顯減弱，30～40 kDa的條帶有加深，說明部分大分子蛋白降解為小分子，發酵至96 h，大分子條帶基本看不到。隨著發酵時間的延長，高分子蛋白片段（high molecular weight protein fractions，HMWF）逐漸減弱，而最下層的小分子條帶逐漸加深，說明發酵的過程中，大部分蛋白質被降解為小分子肽，主要是因為在發酵過程中蛋白質會被蛋白酶迅速水解。GIRI A等[12]在發酵魚醬的研究中也發現類似這一現象。IRIANTO H E等[1，13]的研究也表明魚肉或魚糜在發酵過程中經多種酶（內源蛋白酶、外源性微生物蛋白酶）對魚肉蛋白的作用，使其分解為小分子的肽或是氨基酸。經過發酵，蛋白質被分解為氨基酸和多肽，更有利于人體的消化吸收[14]。

圖2 不同前發酵時間魚腐乳的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE of fish sufu with different pre-fermentation time

2.3 魚腐乳前發酵過程中單因素試驗結果與分析

2.3.1 發酵時間對蛋白酶活力的影響

毛霉在生長過程中會釋放一些以蛋白酶為主的酶系[15]，對腐乳風味的形成有重要的作用。由圖3可知，前發酵時間處于60～96 h階段，魚腐乳蛋白酶活力逐漸增加，發酵至96 h時，蛋白酶活力達到最大值，之后蛋白酶活力逐漸降低，隨著發酵時間的延長，毛霉的菌絲體逐漸老化，影響了蛋白酶的分泌。因此前期的發酵時間應控制在96 h為宜。

圖3 發酵時間對蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of fermentation time on protease activity

2.3.2 發酵溫度對蛋白酶活力的影響

由圖4可知，前期發酵溫度23～27℃時，蛋白酶活力逐漸增大，在這個溫度范圍，隨著溫度的升高，促進了毛霉的生長代謝和蛋白酶的產生，當培養溫度升至27℃時，蛋白酶活力達到最大值；溫度繼續升高，蛋白酶活力開始呈下降趨勢，可能是因為溫度過高，一方面影響了毛霉的生長代謝，另一方面加劇了菌絲體的老化。因此魚豆腐前期發酵的溫度控制在27℃為宜。

圖4 發酵溫度對蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on protease activity

2.3.3 菌懸液接種量對蛋白酶活力的影響

由圖5可知，當菌懸液的接種量＜5%的時候，魚腐乳毛坯的蛋白酶活力隨著菌懸液接種量的增大而增大，當接種量達到5%時，蛋白酶活力達到最大值。菌懸液接種量繼續增大蛋白酶活力開始降低，隨后保持不變，可能是因為菌懸液接種量增大帶來孢子量增加的同時，在代謝過程中會消耗大量的營養物質，而且會破壞毛霉的生長環境，造成菌絲體的老化，從而導致蛋白酶的活力逐漸降低。因此毛霉菌懸液的接種量應控制在5%左右為宜。

圖5 接種量對蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of inoculum on protease activity

2.4 魚腐乳前期發酵工藝優化響應面試驗結果與分析

2.4.1 魚腐乳前期發酵工藝優化響應面試驗結果與分析

采用響應面試驗，以蛋白酶活力（R1）為響應值，以發酵時間（A）、發酵溫度（B）、菌懸液接種量（C）進行前發酵優化，響應面試驗設計結果見表2，方差分析見表3。

由表3可知，模型極顯著（P＜0.0001），因變量與自變量之間的線性關系顯著（R2=0.993 8），模型調整的復相關系數為（R2Adj=0.985 8），說明該模型能解釋98.58%的響應值變化，擬合程度極好，失擬項不顯著（P＞0.05），對模型是有利的，無失擬因素存在。變異系數（coefficient of variation，CV）表示實驗的精確程度，本實驗的CV=2.71%，在接受范圍內。表明相應曲面的擬合程度好，能夠精確的預測實際情況。

表2 發酵條件優化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface methododogy for fermentation conditions optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

以發酵時間（A）、發酵溫度（B）、菌懸液接種量（C）為自變量，蛋白酶活力（Y）為因變量，建立回歸模型。前發酵工藝優化回歸方程為：

2.4.2 響應面法優化發酵條件曲面圖結果分析

圖6 發酵溫度、發酵時間及接種量對魚腐乳前發酵蛋白酶活力影響的響應面與等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,time and inoculum on the activity protease of pre-fermentation of fish sufu

由圖6A可以看出，當菌懸液接種量在5%時，發酵溫度與發酵時間對魚豆腐前期發酵的蛋白酶活力產生交互影響，當發酵時間較短時，蛋白酶活力較低，隨著發酵時間的延長，蛋白酶活力逐漸升高，當發酵溫度繼續升高時，蛋白酶活力較高，兩者的交互作用并不顯著（P=0.6972＞0.05）。

由圖6B可以看出，當發酵溫度為27℃，當菌懸液接種量偏高時，隨著發酵時間的延長，蛋白酶活性逐漸升高，并達到最大值。當發酵時間繼續增大時，隨著菌懸液接種量增大，蛋白酶活力逐漸升高。兩者的交互作用不顯著（P=0.184 1＞0.05）。

由圖6C可以看出，蛋白酶活力隨著發酵溫度的升高，先升高，隨后又逐漸降低，隨著菌懸液接種量增大，蛋白酶活力逐漸升高，并達到最大值，兩者之間的交互作用顯著（P=0.019 5＜0.05）。

響應面方法的圖形是響應值Y與對應的因素A、B、C構成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，每一個響應面圖對其中2個因素進行分析，另外一個因素固定在零水平，從圖中可以直觀的反映出各因素對響應值的影響，結合上述各項參數、三維響應曲面圖和等高圖，運用Design Expert 8.0分析計算找出魚豆腐前期發酵條件的最佳點。根據蛋白酶活力回歸方程，最佳點的值分別為發酵時間103.12 h，發酵溫度27.09℃，菌懸液接種量5.25%，理論蛋白酶活力為53.79 U/g。根據實際生產需要，將發酵條件取值為發酵時間103 h，發酵溫度27℃，菌懸液接種量5.3%，經驗證試驗，該優化工藝條件下蛋白酶活力為51.48 U/g。

3 結論

本研究采用總狀毛霉，對魚腐乳進行前期發酵，發酵至第4天，氨基酸態氮含量升高至0.23%，大部分大分子蛋白降解為小分子。以蛋白酶活力為指標，通過單因素和響應面試驗優化發酵魚腐乳的前發酵條件，得到魚腐乳的前發酵最佳條件為發酵時間103 h，發酵溫度27℃，毛霉菌懸液接種量5.3%，此時的蛋白酶活力為51.48 U/g。形成的酶系為后期發酵的一系列生化反應奠定了良好的基礎，有利于提高魚腐乳的品質，豐富魚腐乳的風味。

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