清香型小曲白酒機械化生產中微生物動態變化研究

陳申習，唐 潔，張 龍，張 磊，夏金陽，楊 強*

（勁牌有限公司 勁牌研究院 中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北 大冶 435100）

小曲清香型白酒從釀造工藝上可分為傳統法和純種根霉釀造兩種類型，傳統法清香型小曲白酒主要分布在湖北、湖南、江西等地。其釀制設備簡單、原料廣泛、用曲量少、發酵周期短、出酒率高、酒體醇厚清雅、綿軟爽凈等優點深受廠家和廣大消費者喜愛[1-3]。與國內其他香型白酒相比，傳統清香型小曲白酒也存在依靠大量人力來完成整個生產過程的弊端。隨著社會經濟的發展，越來越多的行業開始依靠技術的革新、設備的升級來提高生產效率。與此同時，釀酒行業也加大了技術創新的步伐，逐漸開始了借助機械化、自動化、信息化代替傳統釀造工藝的創新探索[4-6]。湖北勁牌有限公司作為清香型小曲白酒的龍頭企業，從2006年就開始了機械化新工藝釀酒的摸索。經過幾年的工藝、設備的自主創新，已建成了機械化、信息化程度高的現代化小曲白酒釀造車間，突破了傳統釀造模式，把大量人力資源從繁瑣的勞動中解放出來，提高了釀造效率，節約了資源，改善了釀酒品質，極大地推動了整個白酒產業轉型升級[7]。

在白酒釀造行業，微生物是支撐產品發展的基礎與核心，研究清楚微生物在發酵過程中群落組成、消長規律、個體功能以及主要功能菌間的互作關系，對于保持與提升公司產品競爭力至關重要。隨著分子生物技術的發展，目前國內外白酒微生物研究者借助先進的高通量測序技術，對傳統白酒釀造過程及環境微生物進行了解析，為白酒微生物的研究開拓了思路[8-11]。但由于白酒釀造環境的特殊性，在整個釀造環境中微生物細胞內存在著復雜的生理生化反應，因而目前行業內對整個釀造過程中微生物種類、數量、代謝機理以及微生物各類群之間復雜而密切的關系還缺乏清晰的認識，進而未能充分發揮出釀酒微生物的最佳功能，一定程度上制約了機械化小曲白酒酒質的快速提升[12-15]。同時，現代釀酒企業普遍存在的酒質、出酒率隨著釀酒原料、季節的不同而產生差異的問題，尚未得到有效解決。分析這些困擾目前企業發展的難題，歸根結底也都與發酵過程中微生物的結構和功能息息相關[16-18]。

因此，為了進一步弄清小曲白酒機械化生產中各類微生物的種類、數量變化情況，在調研前期釀酒微生物研究的基礎上[19-21]，考慮研究的應用性，本研究采用傳統分離培養手段對勁牌有限公司清香型小曲白酒機械化釀造過程中微生物進行了分離鑒定以及數量動態變化跟蹤，以期通過不斷的研究，闡明釀造過程中主要微生物種類及其在發酵過程中的變化規律，為機械化生產工藝的改進、酒質的不斷提升提供技術支撐，從而為社會創造出更多經濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

實驗樣品于2017年3月采自勁牌有限公司機械化發酵車間。

1.1.2 化學試劑

酵母浸粉、酵母膏、葡萄糖、蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司。細菌和真菌基因組DNA提取試劑及引物：上海生工生物技術服務公司。

1.1.3 培養基

WL營養瓊脂培養基：葡萄糖5%，酵母浸粉0.4%，蛋白胨0.5%，硫酸鎂0.012 5%，磷酸二氫鉀0.055%，氯化鉀0.042 5%，氯化鈣0.012 5%，硫酸錳0.000 25%，氯化鐵0.000 25%，溴甲酚綠0.002 2%（滅菌后添加），瓊脂2%，青霉素0.01%，調節pH至6.5，121℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：酵母提取物1%，葡萄糖2%，蛋白胨2%，青霉素0.01%，固體培養基可添加瓊脂粉2%，121℃滅菌30 min。

LB肉湯培養基：胰蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，瓊脂2%，pH 7.0，稱取0.01%制霉菌素加入培養基中，用于抑制霉菌的生長，121℃滅菌30 min。

MRS乳酸菌培養基：蛋白胨1%，牛肉浸膏1%，酵母浸粉0.5%，葡萄糖0.5%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸二胺0.2%，吐溫80 0.1%，七水硫酸鎂0.02%，七水硫酸錳0.005%，磷酸氫二鉀0.2%，瓊脂2%，pH 6.8，121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JJ1000電子天平：常熟雙杰測試儀器廠；SFG-02B電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備儀器廠；QYC-200全溫空氣搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；YXQ-LS-75S蒸汽滅菌鍋、SPX-100B-Z生化培養箱：上海博訊實業有限公司；BCM-1600A潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；NikonECLIPSE E200LEDMV Series顯微鏡：日本Nikon公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集

實驗樣品采自勁牌有限公司機械化發酵車間，目前車間糖化培菌時間為1 d，發酵周期為15 d，一個發酵批次總計16 d。每個車間每天連續進行一個發酵批次。本研究選擇糖化后時間點為一個取樣點，發酵0～15 d每天固定時間取一次樣，故一個發酵批次總計取樣17次，每次取樣固定一個發酵槽車并采用三點一線取樣方法[22]，為了獲得不同生產批次數據，便于結果對比分析，選擇同一個車間相鄰4個發酵批次進行取樣，共68個樣品。

1.3.2 菌株分離純化

準確稱取每份酒醅樣品5 g，放入裝有95 mL無菌水并帶有玻璃珠的250 mL三角瓶中，200 r/min振蕩30 min，使酒醅與水充分混合，制成菌懸液。吸取1 mL所得菌懸液注入裝有9 mL無菌水的試管中，標記為10-1稀釋度，按照同樣的方法依次制成10-2、10-3、10-4稀釋度的菌懸液。分別從標記為10-1、10-2、10-3和10-4稀釋度試管中吸取0.2 mL溶液分別置于無菌WL、YPD、LB和MRS培養基中，每個梯度設置兩個平行。采用平板涂布法，吸取200 μL菌液，用無菌玻璃涂棒在平板上涂布均勻，然后平放于試驗臺上20～30 min，使菌液滲入培養基表層內，再將平板分別倒置于30℃（真菌）、37℃（細菌）培養箱中培養。培養24～72 h后，采用菌落記號方式進行酵母和細菌單菌落數的統計，統計完成后用無菌接種環挑出平板上的單個菌落，劃線接種于新的培養基平板上，繼續培養48～72 h。經過2～3次平板劃線后得到初步純化的菌落轉入相應斜面試管于4℃冰箱保存。

菌落計數方式：根據樣品培養結果挑選菌落數在30～300的平板進行統計，最后總數乘以稀釋倍數即可算出不同微生物的總數。進一步把平板上所有菌落轉移到相應培養基平板上，培養2 d后通過形態及分子鑒定，可獲得樣品中微生物百分比。

1.3.3 菌株的鑒定

（1）菌株的形態特征觀察

根據菌落的顏色、邊緣、透明度、大小等特征挑選培養皿上單菌落并進行劃線純化。細胞形態借助顯微鏡觀察，菌株的表型特征參考常見細菌、真菌系統鑒定手冊進行描述分類[23-24]。

（2）菌株溫度耐受性實驗

分別將酵母浸出粉胨葡萄糖、LB肉湯培養基、MRS乳酸菌培養基液體培養基分裝至10 mL試管，滅菌備用，然后將酵母、細菌種子液（108CFU/mL）以3%的接種量加入相應試管中，分別在15℃、25℃、30℃、45℃、55℃培養48 h，測定其吸光度值。

（3）菌株分子生物學鑒定

對分離得到的微生物進行基因組（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取，以得到的脫氧核糖核酸DNA產物為模板分別使用真菌通用引物內轉錄間隔1區（internal transcribedspacer 1，ITS1）和ITS4以及細菌通用引物27F/1492R擴增對應的區域，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增產物經電泳檢測，引物及反應條件見表1。

表1 引物信息和PCR反應條件Table 1 Primer information and PCR reaction conditions

2 結果與分析

2.1 菌株的形態描述

通過觀察50株真菌和60株細菌的平板菌落及顯微形態，結果分別見圖1和表2。由圖1和表2結果結合常見菌株鑒定手冊，對菌株形態進行了初步描述，酵母可分為4種類型、霉菌可分為2種類型、細菌可分為6種類型：

圖1 各菌株菌落形態Fig.1 Colony morphology of each strain

表2 菌株形態特征Table 2 Morphological characteristics of strains

2.2 菌株的溫度耐受實驗

從上述類型酵母和細菌各選擇一株進行耐溫測試（菌株編號同相應類型編號）。分別在15℃、25℃、30℃、45℃、55℃培養48 h后，測定吸光度值，結果見圖2。

圖2 不同溫度下酵母和細菌的生長狀況Fig.2 Growth status of yeasts and bacteria under different temperature conditions

由圖2可知，4株酵母在25℃和30℃生長良好，但隨著溫度升高，OD600nm值下降較快，45℃時，酵母生長受到明顯抑制。而菌株Y1在45℃生長相對較好，具有一定的耐熱能力，可以適應清香型小曲白酒糖化時40℃的溫度。細菌在30℃生長良好，耐熱性強于酵母，在55℃時生長活性減弱。

2.3 菌株的分子生物學鑒定

將分離自發酵酒醅中的50株真菌和60株細菌進行基因組DNA提取，并以此為模板分別使用真菌通用引物內轉錄間隔（internal transcribed spacer，ITS）1區和ITS4區以及細菌通用引物27F/1492R擴增對應的區域，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增產物經電泳檢測，純化后的產物進行測序，將測序結果在美國國家生物技術信息中心（nationalcenterforbiotechnologyinformation，NCBI）數據庫上進行相應序列比對，與庫中菌株同源序列相似性≥99%即初步鑒定該序列所對應的菌種。各類別菌株鑒定見表3與表4。

表3 酒醅真菌鑒定結果Table 3 Identification results of fungi from the fermented grains

對發酵酒醅分離的50株真菌進行菌株鑒定，結合形態，其中確定4種酵母（分別編號為Y1～Y4），包括5株異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、30株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、3株庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、2株盔形畢赤酵母（Pichia manshurica）。2種霉菌（編號為M1，M2），分別為2株分枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）和8株米根霉（Rhizopus oryzae）。

表4 酒醅細菌鑒定結果Table 4 Identification results of bacteria from the fermented grains

從酒醅中分離獲得60株細菌，結合形態描述，經分子鑒定分別屬于6個細菌種群（編號為B1～B6），如表4所示。包括5株類地衣芽孢桿菌（Bacillus paralicheniformis）、4株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、5株干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、10株短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、8株希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）、28株瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus），發酵后期氧氣消耗殆盡，且酸度增高，乳酸菌繁殖較快，占比在90%以上，如瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

2.4 發酵過程數量動態變化分析

對發酵過程進行15 d的微生物計數，每隔24 h取樣，每次取樣2 kg，每次選擇3個重復進行微生物總數統計，連續跟蹤統計4個發酵批次，分析車間工藝執行情況。其中酵母菌及細菌數量變化結果分別見圖3及圖4。

圖3 酒醅酵母數量動態變化Fig.3 Dynamic change of yeast number in the fermented grains

由圖3可知，酒醅在完成入池后，酵母菌的活菌數量呈一個先增多后降低的趨勢。在發酵初期，由于發酵容器剩余氧氣的存在，酵母菌處于一個快速繁殖期，在發酵第2天時酵母總數增殖到最大值，達到108CFU/g。隨著發酵過程的進行，氧氣逐漸消耗，酵母增殖緩慢，活菌數量開始逐漸下降，在發酵第5天后，數量穩定在107CFU/g。因此，在入池第2天時會達到最大生長量。除去不同批次投糧、下曲、糖化、發酵等因素導致的部分時間點酵母數量有微弱差異外，4個批次之間酵母總數總體變化趨勢一致，從多個批次相互驗證揭示了酵母數量變化規律，也從側面反映出車間工藝參數控制的穩定性。

圖4 酒醅細菌數量動態變化Fig.4 Dynamic change of bacteria number in the fermented grains

由圖4可知，而細菌在酒醅入池后，菌群生長先經歷了一個遲滯期，后呈緩慢上升趨勢。在發酵的前9d，細菌菌群處于遲緩期，從第10天開始，細菌數量逐漸升高至106CFU/g，此后，細菌增殖較快，總數可以達到107CFU/g。由于固態發酵包括投糧、下曲、糖化、發酵等多個環節，且特殊的密閉發酵環境無法保證不同批次微生物絕對的一致性。因此，不同發酵批次細菌總數在發酵后期略有差異，但總體變化趨勢較一致，體現了車間生產的穩定可控。

3 結論

本次研究采用傳統分離方法對勁牌清香型小曲白酒機械化釀造過程中微生物種類與數量變化進行了分析統計，并結合形態描述和現代分子技術對所分離菌株進行了鑒定，共得到了4種酵母菌、2種霉菌和6種細菌，分別為異常威克漢姆酵母（W.anomalus）、釀酒酵母（S.cerevisiae）、庫德里阿茲威畢赤酵母（P.kudriavzevii）、盔形畢赤酵母（P.manshurica）、分枝橫梗霉（L.ramosa）、米根霉（R.oryzae）、地衣芽孢桿菌（B.paralicheniformis）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、干酪乳桿菌（L.casei）、短乳桿菌（L.brevis）、希氏乳桿菌（L.hilgardii）、瑞士乳桿菌（L.helveticus）。其中，酵母中以釀酒酵母占絕對優勢，起主要發酵作用。其他酵母如異常威克漢姆酵母、庫德里阿茲威畢赤酵母為生香酵母，細菌中主要為乳酸桿菌，且在發酵后期增殖較快。同時，本研究對清香型小曲白酒機械化發酵過程中微生物數量變化趨勢進行了分析總結，得出了酵母和細菌總數在發酵過程中的變化規律，其中酵母總數在發酵過程中先后經歷了快速增殖和逐漸死亡的過程，最大數量可以達到108CFU/g。而細菌在發酵前期數量穩定在106CFU/g左右，隨著后期發酵環境的改變，為細菌的增殖提供了適合的環境，發酵結束前數量可以升至107CFU/g以上。本研究通過對4個連續發酵批次酒醅微生物分析，從微生物培養結果可以看出各批次微生物變化規律較一致，揭示了車間微生物的整體變化規律，也間接反映出了車間工藝管控的穩定。以上研究結果為后期升級清香型小曲白酒機械化工藝提供了菌株資源，也為監控生產工藝提供了重要的微生物參數指標。

[1]李大和，曹遠亮，王進明，等.三種復合香型白酒特點比較[J].釀酒，2016，43（1）：26-30.

[2]庾昌文，薛棟升，郭 威，等.酒醅中高產淀粉酶酵母的分離鑒定及產酶條件研究[J].釀酒，2015，42（5）：71-75.

[3]劉 永.不同發酵容器對云南小曲清香型白酒風味的影響[N].華夏酒報，2015-09-15（C48）.

[4]蔡鳳嬌.固態法小曲白酒機械化釀造工藝技術研究[D].武漢：湖北工業大學，2013.

[5]汪江波，王 炫，黃達剛，等.我國白酒機械化釀造技術回顧與展望[J].湖北工業大學學報，2011，26（5）：50-54.

[6]劉 朋，李志揚，倪紅軍，等.白酒釀造設備的發展現狀與展望[J].中國釀造，2017，36（1）：24-28.

[7]楊強.勁牌公司白酒生產機械化發展歷程與體會——在全國第四屆清香型白酒高峰論壇上的發言[J].釀酒，2011，38（5）：12-13.

[8]HUANG Y,YI Z,JIN Y,et al.Metatranscriptomics reveals the functions and enzyme profiles of the microbial community in Chinese nong-flavor liquor starter[J].Front Microbiol,2017,8:1747.

[9]WANG X,DU H,ZHANG Y,et al.Environmental microbiota drives microbial succession and metabolic profiles during Chinese liquor fermentation[J].Appl Environ Microbiol,2017:AEM.02369-17.

[10]SONG Z,DU H,ZHANG Y,et al.Unraveling core functional microbiota in traditional solid-state fermentation by high-throughput amplicons and metatranscriptomics sequencing[J].Front Microbiol,2017,8:1294.

[11]PANG X N,HAN B Z,HUANG X N,et al.Effect of the environment microbiota on the flavour of light-flavourBaijiuduring spontaneous fermentation[J].Sci Report,2018,8(1):3396.

[12]王萬能，王 鵬，王 東，等.多糧小曲清香型白酒發酵過程中微生物動態變化研究[J].重慶理工大學學報，2011（11）：30-33.

[13]JIN G,ZHU Y,XU Y.Mystery behind Chinese liquor fermentation[J].Trend Food Sci Technol,2017,63:18-28.

[14]邊名鴻，萬世旅，代 梅，等.產酒酵母的篩選鑒定及其在小曲中的應用[J].中國釀造，2016，35（3）：57-60.

[15]王 薇，吳 群，徐 巖.清香型白酒固態釀造過程中酵母種群結構和多樣性分析[J].微生物學通報，2012，39（9）：1272-1279.

[16]趙群麗.醬香大曲中釀酒微生物的篩選及發酵工藝研究[D].貴陽：貴州大學，2016.

[17]陳育新，韓 珍，郭慶東.中國白酒中呈香呈味物質研究進展[J].食品研究與開發，2015，36（2）：140-142.

[18]沈永祥，周 敏，薛棟升，等.小曲白酒機械化釀造過程中酒醅微生物的種屬鑒定及生物安全性分析[J].釀酒，2014，41（5）：31-34.

[19]庾昌文，薛棟升，周 敏，等.清香型小曲白酒機械化釀造過程中細菌多樣性及釀造性能分析[J].湖北農業科學，2016（11）：2860-2863.

[20]吳樹坤，楊 磊，楊玲麟，等.沉香型酒醅中產香芽孢桿菌的分離鑒定及代謝產物分析[J].中國釀造，2018，37（1）：35-40.

[21]胡開禮.機械化小曲白酒釀造工藝研究[D].武漢：武漢工程大學，2015.

[22]汪江波，周 敏，沈永祥，等.白酒機械化釀造過程中主要風味物質的生成規律[J].湖北農業科學，2014，53（22）：5499-5503.

[23]蔡妙英，東秀珠.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001：23-28.

[24]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979：37-42.