長(zhǎng)沙臭豆腐鹵水生產(chǎn)工藝優(yōu)化探討

侯艷梅，賀 靜，廖盧艷，石 聰，3，蔣立文，3*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.海普諾凱營(yíng)養(yǎng)品有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410003；3.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

鹵水發(fā)酵是長(zhǎng)沙臭豆腐制作的關(guān)鍵步驟之一，一般采用竹筍、瀏陽(yáng)豆豉、香菇為主料，適當(dāng)添加豆腐腦等進(jìn)行混合發(fā)酵，混合發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1年以上，發(fā)酵條件粗放、周期長(zhǎng)、不標(biāo)準(zhǔn)、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定是限制長(zhǎng)沙臭豆腐規(guī)模化生產(chǎn)發(fā)展的重要瓶頸。白豆腐放入鹵水中鹵制是長(zhǎng)沙臭豆腐的主要工序，作為長(zhǎng)沙臭豆腐的重要特點(diǎn)“聞起來(lái)臭，吃起來(lái)香”，鹵水是臭豆腐“臭”的主要來(lái)源，滋味也與鹵水成分密切相關(guān)。鹵水揮發(fā)性成分是表現(xiàn)發(fā)酵品風(fēng)格和特征性差異的重要方面之一，已經(jīng)引起學(xué)者關(guān)注。大量研究發(fā)現(xiàn)臭豆腐鹵水共性物質(zhì)主要是苯酚類(lèi)和吲哚類(lèi)物質(zhì)[1-2]。謝靚[3]對(duì)臭豆腐鹵水揮發(fā)性指紋圖譜進(jìn)行了研究，獲得了采用微固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定臭豆腐鹵水揮發(fā)性成分的最佳萃取條件和測(cè)定參數(shù)。李雨楓等[4]研究了臭豆腐鹵水發(fā)酵過(guò)程中微生物變化，發(fā)現(xiàn)在鹵水發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌總數(shù)數(shù)量級(jí)在108CFU/mL以上。石聰?shù)萚5]研究了在發(fā)酵成熟的鹵水中加入一定數(shù)量保護(hù)劑后進(jìn)行真空冷凍干燥，檢測(cè)臭豆腐鹵水凍干前后微生物總數(shù)的變化并比較3種臭豆腐鹵水及其凍干粉復(fù)水后揮發(fā)性成分，凍干粉制備為標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供借鑒。趙國(guó)忠等[6]研究發(fā)現(xiàn)，臭豆腐鹵水中主要細(xì)菌為漫游球菌（Vagococcus carniphilus）、沙克乳桿菌（Lactobacillussakei）、地衣芽孢桿菌（Enterococcus avium）、鳥(niǎo)腸球菌（Enterococcus devriesei），鳥(niǎo)腸球菌單獨(dú)純種發(fā)酵所得的臭豆腐樣品色澤較好，香氣成分也較濃郁。但目前南方臭豆腐鹵水基礎(chǔ)研究還不是很多。

考慮到傳統(tǒng)臭豆腐鹵水發(fā)酵時(shí)間太長(zhǎng)，參與反應(yīng)原料較多，為便于控制，為規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。根據(jù)已有資料報(bào)告，考慮到瀏陽(yáng)豆豉[7]、竹筍[8-10]、香菇[11]在發(fā)酵過(guò)程中帶來(lái)的風(fēng)味與臭味差別較大，因此猜測(cè)臭豆腐中臭味物質(zhì)主要可能來(lái)源于豆腐發(fā)酵。本研究以某品牌不同年限兩種臭豆腐鹵水作對(duì)照，直接利用黃漿水加一定比例白豆腐進(jìn)行控溫發(fā)酵，采用固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，研究臭豆腐鹵水和臭豆腐特征性揮發(fā)成分及對(duì)其貢獻(xiàn)的化合物，這對(duì)于臭豆腐工業(yè)化控制及品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化具有一定的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹵水A、B由湖南某品牌臭豆腐生產(chǎn)企業(yè)取樣（A為發(fā)酵三年的鹵水、B為發(fā)酵兩年的鹵水）。鹵水C為泡豆腐水，主要原料為黃漿水加入30%白豆腐直接浸泡30～37℃保溫發(fā)酵1個(gè)月所得。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水機(jī)：美國(guó)Millipore公司；DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋、101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；Talboys數(shù)顯型磁力加熱攪拌器：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）（75 μm）萃取針頭：美國(guó)Supelco公司；島津GCMSQP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本SHIMADZU（島津）公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

固相微萃取頭在每次首次使用時(shí)必須在進(jìn)樣口進(jìn)行老化，將PDMS萃取頭在300℃的條件下活化60 min，直至色譜檢測(cè)無(wú)雜峰出現(xiàn)。稱(chēng)取研磨均勻的臭豆腐1.00 g放入20 mL SPME樣品瓶中，加入4.00 mL超純水搖勻，用密封墊與鋁帽進(jìn)行密封，密封后在70℃的條件下利用磁力攪拌器加熱平衡20 min，攪拌速度為200 r/min，將已活化的萃取頭通過(guò)隔墊頂空插入樣品瓶?jī)?nèi)，推出纖維頭，使之距樣品液面約1 cm，頂空吸附40 min，在拔出萃取頭前抽回纖維頭，再將萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口，并且推出纖維頭，在240℃條件下解吸5 min。臭豆腐鹵水則吸取2.00 mL放入20 mL SPME樣品瓶中，用密封墊與鋁帽進(jìn)行密封，密封后在60℃的條件下利用磁力攪拌器加熱平衡40 min，其他同上。

1.3.2 氣質(zhì)聯(lián)用色譜條件

色譜柱為CD-WAX彈性石英毛細(xì)管柱（30cm×0.25mm×0.25 μm）；載氣為高純（純度99.999%）氦氣，氦氣流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度240℃；不分流進(jìn)樣。程序升溫：柱溫50℃，保持2 min，以5℃/min升溫至200℃，保持14 min，以15℃/min升溫至240℃。

質(zhì)譜條件：離子源為電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度200℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流150 μA；倍增器電壓1 037 V；接口溫度220℃；質(zhì)量掃描范圍45～500 m/z。

1.3.3 定性定量分析

總離子流色譜圖經(jīng)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standard technology，NIST）2014s標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索定性鑒定出成分，采用面積歸一法進(jìn)行定量分析，得到各成分在臭豆腐鹵水揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹵水A、鹵水B及鹵水C中的揮發(fā)性成分總離子流色譜圖

鹵水A、鹵水B及鹵水C中揮發(fā)性成分GC-MS分析的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 鹵水A(a)、鹵水B(b)及鹵水C(c)揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components from brine A(a),brine B(b)and brine C(c)analysis by GC-MS

2.2 三種鹵水中主要揮發(fā)性物質(zhì)成分分析結(jié)果

鹵水A、鹵水B及鹵水C中揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鹵水A、B及C中的主要揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table 1 Results of main volatile components in brine samples A,B and C analysis by GC-MS

續(xù)表

續(xù)表

2.3 三種鹵水主要揮發(fā)性成分結(jié)果分析

由表1可知，在鹵水A中，利用萃取頭鑒定出了37種物質(zhì)。其中酸類(lèi)10種、酚酮類(lèi)9種、醇類(lèi)8種、酯類(lèi)3種、烷烯類(lèi)2種、萘類(lèi)2種、其他類(lèi)3種。從種類(lèi)數(shù)量上來(lái)看，酸類(lèi)、酚酮類(lèi)、醇類(lèi)可能是鹵水A中重要的氣味物質(zhì)的來(lái)源；從相對(duì)含量上分析，酚酮類(lèi)的相對(duì)含量為60.61%，酸類(lèi)為18.24%。酸類(lèi)和酚酮類(lèi)，從相對(duì)含量上分析可能是鹵水A的揮發(fā)性組分的重要來(lái)源。

在鹵水B中，利用萃取頭鑒定出了47種物質(zhì)。其中萘類(lèi)19種、苯類(lèi)9種、烷烯類(lèi)6種、醇類(lèi)5種、酚酮類(lèi)4種、茚類(lèi)2種、其他類(lèi)2種。從種類(lèi)數(shù)量上來(lái)看，萘類(lèi)、苯類(lèi)、烷烯類(lèi)可能是鹵水B中重要的氣味物質(zhì)的來(lái)源；萘類(lèi)的相對(duì)含量為61.41%，苯類(lèi)為15.66%，醇類(lèi)為6.56%，苯酚類(lèi)和吲哚類(lèi)也有一定含量，可能是鹵水B的“臭味”成分的重要來(lái)源。其他種類(lèi)的揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量較少，但是有有其獨(dú)特的風(fēng)味，可能與鹵水B的風(fēng)味形成至關(guān)重要。如苯乙酮具有山楂花香氣，金合歡和含羞草似的香韻。甲基庚烯酮有強(qiáng)烈的油脂氣息，持有新鮮的青香，伴有柑橘香韻。甲基壬基甲酮有油脂氣息、草香香氣，并帶有柑橘似的香韻。

在鹵水C中，利用萃取頭鑒定出了48種物質(zhì)。在鹵水C中萃取頭鑒定出萘類(lèi)13種、苯類(lèi)10種、烷烯類(lèi)8種、酚酮類(lèi)7種、醇類(lèi)3種、茚類(lèi)2種、酸類(lèi)2種，其他類(lèi)3種。從種類(lèi)數(shù)量上來(lái)看，萘類(lèi)、酚酮類(lèi)、烷烯類(lèi)可能是鹵水C中重要的氣味物質(zhì)的來(lái)源；從相對(duì)含量上分析，萘類(lèi)的相對(duì)含量為35.32%，苯類(lèi)為36.42%，烷烯類(lèi)為7.17%，烷烯類(lèi)沒(méi)有味道，苯類(lèi)和萘類(lèi)均有特殊氣味，但其他種類(lèi)的揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量較少，也可能與鹵水C的風(fēng)味形成至關(guān)重要。例如，異戊酸具有強(qiáng)烈的不愉快的氣味和酸味，高度稀釋后則有甜潤(rùn)的果香以及篤斯越桔樣的香味。雪松醇有持久的柏木樣的木香氣息等[12-13]。

綜述上面3種鹵水，部分成分相對(duì)含量較低，其可能敏感氣味閾值很低，如吲哚、苯酚類(lèi)，感受閾值0.01 μg/kg左右，濃度較低有花香味道，稍微高些就有特殊臭味，鹵水樣中共有揮發(fā)性物質(zhì)見(jiàn)表2。

表2 鹵水樣中共同含有的揮發(fā)性成分Table 2 Common volatile substances in brine samples

在以上的共有物質(zhì)中，3-甲基吲哚是在鹵水中始終含有的物質(zhì)，3-甲基吲哚具有強(qiáng)烈的糞便臭味，稀釋后有令人愉快的花香和動(dòng)物型香氣，并帶有成熟的水果香味。鹵水A、B中共有的物質(zhì)有6種，α-松油醇具有松木和丁香似的香氣，而柏木腦有溫柔的柏木香氣，香氣質(zhì)量取決于原料品種和提純的程度。其中β-柏木烯具有木香氣息。2-乙基-4-甲基噻唑是具有咖啡揮發(fā)性香味組分之一，有咖啡、炒榛子等堅(jiān)果樣香味。鹵水A、C中共同物質(zhì)包括5種，其中4-甲基苯酚具有“窖泥臭”，α-松油醇具有類(lèi)似紫丁香的香氣，稀釋后具有桃的甜味；苯酚對(duì)臭豆腐的香氣起到增穩(wěn)定性起到了一定作用，并且具有防腐和殺菌的作用，它的存在對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性起到了一定作用。鹵水B、C中的共同物質(zhì)有16種。將三種鹵水的共同成分對(duì)比，得到3-甲基吲哚是具有特殊“臭味”主要成分來(lái)源，從三種鹵水共有成分來(lái)說(shuō)，借助經(jīng)驗(yàn)評(píng)判結(jié)合實(shí)際測(cè)定相對(duì)含量，臭味成分基本上是類(lèi)似的。

2.4 討論

鹵水中復(fù)雜的揮發(fā)性成分與原料來(lái)源發(fā)酵過(guò)程中微生物有關(guān)，而賀靜[1]在臭豆腐鹵水發(fā)酵過(guò)程中鑒定出揮發(fā)性成分共122種成分，核心氣味物質(zhì)吲哚類(lèi)、苯酚類(lèi)物質(zhì)在鹵水中始終存在，這些物質(zhì)構(gòu)成了是臭豆腐臭香味主體物質(zhì)，其含量與鹵水發(fā)酵時(shí)間密切相關(guān)。

豆腐本身的氣味成分與黃豆品種及加工工藝有密切關(guān)系，大豆豆腥味一直是研究關(guān)注熱點(diǎn)，SMOUSE T H等[14-15]早在20世紀(jì)中葉就研究過(guò)，己醛和正已醇是豆腥味主要成分。楊森等[16-19]對(duì)不同品種和不同發(fā)育時(shí)期的大豆進(jìn)行分析和加工豆奶、脂肪氧化酶產(chǎn)物等分析揮發(fā)性成分差異較大，主要包括醛類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)、呋喃類(lèi)、烴類(lèi)、酸鹽類(lèi)和呋喃類(lèi)等，且相互間的差異較大。KOHAYASHI A等[20-21]研究了豆類(lèi)制品致腥揮發(fā)性成分基本上集中在醇類(lèi)、醛類(lèi)等主要成分，只是種類(lèi)差異較大。而選用不用的大豆和不同的工藝測(cè)定的揮發(fā)性成分均有差異，本研究測(cè)定出的揮發(fā)性成分相對(duì)含量主要為醇類(lèi)、酯類(lèi)和烷烴類(lèi)物質(zhì)，而其重要的氣味成分可能是醇類(lèi)、酸類(lèi)、烷烴類(lèi)。

不同配料及不同發(fā)酵時(shí)間臭豆腐鹵水主體氣味是有很大的差異，本研究針對(duì)豆腐與鹵水的氣味成分的關(guān)系進(jìn)行探討，在鹵水中主要的成分物質(zhì)可能是其原料中的物質(zhì)本身和經(jīng)過(guò)發(fā)酵而產(chǎn)生。蔣立文等[7]指出在瀏陽(yáng)豆豉的特殊香氣成分與愈創(chuàng)木酚和吡嗪有密切的關(guān)系。芮漢明等[22]用GC-MS分析香菇的揮發(fā)性成分主要是一些硫和八碳的化合物，其中二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、甲硫基二甲基三硫醚、1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷、香菇精是香菇的特征風(fēng)味成分，以含硫的雜環(huán)化合物最為重要。安晶晶等[23]用蒸餾萃取（distillationextraction，SDE）和GC-MS檢測(cè)鮮香菇中八碳化合物含量為44.13%，含硫化合物含量為21.53%；1-辛烯-3-醇是鮮香菇最特征的風(fēng)味物質(zhì)。任旺等[8]采用GC-MS對(duì)麻竹筍中多酚類(lèi)化合物檢測(cè)，共鑒定出24種揮發(fā)性物質(zhì)，其中含量較高的物質(zhì)有乙酸、4-對(duì)羥基苯甲醛、4-對(duì)羥基苯乙睛、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4-吡喃、1,2,3,5-四羥基環(huán)己烷和丙酮醇等，而鄰苯二酚和3-甲基鄰苯二酚為提取物中的揮發(fā)性酚類(lèi)的主要物質(zhì)。

從本設(shè)計(jì)方案來(lái)看，某品牌鹵水發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，并且成分比較復(fù)雜，含有竹筍、瀏陽(yáng)豆豉、香菇、豆腐、黃漿水等原料各種成分以及長(zhǎng)時(shí)間自然發(fā)酵微生物代謝產(chǎn)物，這些成分與產(chǎn)物又會(huì)發(fā)生復(fù)合作用形成多種其他物質(zhì)如酯類(lèi)等，而從傳統(tǒng)鹵水實(shí)際控制過(guò)程來(lái)看，在長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵過(guò)程中需要不斷補(bǔ)充豆腐這類(lèi)物質(zhì)作為鹵水活性保持重要因素；豆腐加黃漿水混合發(fā)酵主體物質(zhì)基礎(chǔ)為大豆主要成分，發(fā)酵過(guò)程中主要微生物源自環(huán)境和原料本身帶入，所以C樣品中主要產(chǎn)物是大豆蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量要比A、B樣品高得多，其特征代謝產(chǎn)物在揮發(fā)性成分指標(biāo)上與對(duì)照樣品差別較大，而滋味成分方面可能比前面對(duì)照樣品具有更大優(yōu)勢(shì)，這應(yīng)該是下一步需要研究主要內(nèi)容之一。目前探討主要還是集中在純豆腐黃漿水發(fā)酵是否可以形成臭豆腐鹵水中“臭”揮發(fā)性指紋圖譜相似的物質(zhì)，這將為鹵水生產(chǎn)規(guī)?；a(chǎn)調(diào)整提供理論參考。3結(jié)論

臭豆腐風(fēng)味小吃要求的不僅是氣味成分，還需要滋味成分存在才構(gòu)成南方臭豆腐的特殊味道，這需要將采用滋味成分綜合評(píng)價(jià)相結(jié)合才能確定，因此本研究探討的采用純黃漿水結(jié)合豆腐控制發(fā)酵形成臭味具有可行性，結(jié)果表明，不同來(lái)源鹵水在不同發(fā)酵階段的主體物質(zhì)均不同，泡豆腐水（鹵水C）和某品牌鹵水（鹵水A、鹵水B）臭豆腐揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量差別較大，分別有48種，37種、47種。一方面為了傳統(tǒng)產(chǎn)品特色需要有老鹵水存在，另外規(guī)模化生產(chǎn)需要大量鹵水，完全依賴(lài)于老鹵水無(wú)法形成產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，所以研究為臭豆腐鹵水簡(jiǎn)化工藝提供了可能，但是否完全可以替代傳統(tǒng)鹵水制作工藝或需要發(fā)酵工藝優(yōu)化，這需要以后進(jìn)一步深入研究。

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