丁酸梭菌優良菌株LXYB-2抑菌活性及抗逆性研究

謝麗靜，王 麗，王偉華，王海寬，張仁文*

（1.湖北綠雪生物科技有限公司，湖北 咸寧 437000；2.塔里木大學 生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；3.天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）屬于厭氧革蘭氏陽性菌，電子顯微鏡下觀察其菌體形態呈直或略有彎曲的桿狀，單個或成對，部分呈絲狀，短鏈，白色略帶灰感，細菌直徑為（0.6～1.4）×（2.7～7.3）μm，菌體中間略飽滿，兩端呈鈍圓形，周身有鞭毛，具運動性[1]。研究表明丁酸梭菌作為益生菌制劑中的一種，又稱活菌制劑[2]，不僅具有抑制腸道有害菌群的生長作用，同時能夠促進有益菌群的增殖[3]；其作用機理可歸結為丁酸梭菌益生菌產生的非特異性短鏈脂肪酸和過氧化物以及其代謝產生的特異性的細菌素，能夠抑制或殺死潛在的致病菌[4]。

丁酸梭菌是我國在2009年由農業部批準允許在飼料中添加的活菌制劑之一。微生態制劑是否能作為飼料添加劑應用于養殖業，不僅需要考察菌株的發酵水平、產益生物質的能力，同時還需要考察菌株抗逆性，如在動物胃腸道環境中生存能力，耐受飼料加工過程中的高溫環境等。丁酸梭菌作為一種梭狀芽孢桿菌，具有一定耐高溫、耐動物胃腸道環境的能力，但是這些特性在不同菌株之間存在較大的差異。賈麗楠等[5]對丁酸梭菌85℃高溫處理2.5 min、5.0min、7.5min后，其存活率分別為70.43%、52.69%、46.35%。劉磊等[6]將丁酸梭菌CBM01在人工胃液和人工腸液中作用3 h后，丁酸梭菌CBM01存活率分別為90.33%和92.09%，同時發現菌株CBM01可耐受的最高膽鹽濃度為0.40%。王騰浩等[7]對一株丁酸梭菌ZJU-F1抗逆性和體外益生效果進行了研究，發現該菌株對人工胃液、腸液及膽堿都具有很好的耐受性，pH值為2的人工胃液處理對其幾乎沒有影響，然后再用人工腸液處理2 h，活菌數沒有明顯變化；該菌株能夠在0.35%的膽鹽條件下生長。體外抑菌活性比較也是考察菌株產抑菌活性物質能力的一種方法，一般認為在同樣的環境條件下，對動物體內常見病原菌抑菌活性較強的菌株其產抑菌活性物質能力更強，因此需要比較不同菌株對腸道常見致病菌抑制效果，來進一步評價優良菌株的應用潛力。曹廣添等[8]研究發現，將丁酸梭菌分別與大腸桿菌、沙門菌、產氣莢膜梭菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌按不同的比例混合后進行培養，培養時間36～48 h，結果表明，丁酸梭菌對大腸桿菌、沙門菌和產氣莢膜梭菌的增殖有明顯抑制作用。

目前國內外對丁酸梭菌抗逆性的研究主要集中對自然選育得到的菌株抗逆性研究，而對突變菌株的抗逆性研究鮮有報道。本研究以一株通過常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasm，ARTP）誘變篩選到的優良菌株LXYB-2為研究對象，比較了優良菌株LXYB-2與起始菌株LXKJ-1的抑菌能力及高溫、人工胃液、人工腸液、膽堿的耐受性，以確定優良菌株LXYB-2的應用潛力，為進一步的篩選和挖掘益生菌的應用潛力提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 菌株來源

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）LXKJ-1為出發菌株（菌株保藏號為CCTCCM201613）：由湖北綠雪生物有限公司研發中心提供；丁酸梭菌優良菌株LXYB-2是本實驗室以LXKJ-1作為出發菌株，通過ARTP誘變處理，經初篩、復篩、遺傳穩定性試驗，得到一株耐丁酸、遺傳穩定性好、發酵水平高的突變優良菌株。

靶標菌：大腸埃希氏菌（Escherichiacol）iCMCC（B）44103，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）MASA，表皮葡萄球菌（S.epidermidis）CMCC26069，宋內志賀氏菌（Shigella sonnei）CMCC（B）51592，單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC19114，傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi）CMCC（B）50071，鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium）ATCC14028，腸炎沙門氏菌（S.enteritidis）CMCC（B）50335，福氏志賀氏菌（S.flexneri）CMCC（B）51572：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.2 培養基

強化梭菌培養基（reinforced clostridial medium，RCM）、LB瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養基：海博生物技術有限公司。

斜面培養基：酵母浸膏0.5%，胰蛋白胨0.5%、葡萄糖0.1%、磷酸氫二鉀0.1%，瓊脂粉1.5%，pH值7.0。

種子培養基：RCM液體培養基。

液體發酵培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉10.0 g，酵母粉3.0 g，葡萄糖5.0 g，可溶性淀粉1.0 g，L-半胱氨酸鹽粉3.0 g，磷酸氫二鉀 0.05 g，硫酸鎂0.08 g，硫酸錳0.002 g，純化水1 000 mL，pH 7.0。

活菌計數培養基：胰蛋白胨1.0 g，大豆蛋白胨0.5 g，酵母浸粉0.3 g，蛋白胨1 g，氯化鈉0.3 g，硫代乙醇酸鈉0.03 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.03 g，磷酸氫二鉀0.25 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂粉2.0 g，pH 6.5。

以上培養基制備完成后均需高壓滅菌備用，滅菌溫度121℃，滅菌時間20min。

1.1.3 化學試劑

胰蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；玉米粉：河南振興生物技術有限公司；葡萄糖、硫酸銨、尿素、磷酸氫二鉀（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；豬膽鹽（純度＞98%）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

GL-16A高速冷凍離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；XSP-24N生物顯微鏡：南京江南永新光學有限公司；MD-0.6型脈動真空滅菌柜：張家港市歐思瑞科技有限公司；M2204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FS-CJ-2F垂直送風超凈工作臺：蘇州馮氏實驗動物設備有限公司；BMJ-250C培養箱：上海博迅實業有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 優良菌株LXYB-2與初始菌株LXKJ-1的抑菌活性比較

（1）丁酸梭菌發酵液的制備

將甘油管保藏的菌株LXYB-2與出發菌株LXKJ-1分別取0.1mL接種到10mL液體RCM培養基中，厭氧培養18h，備用。

將活化的突變優良菌株LXYB-2與出發菌株LXKJ-1分別接種于種子液培養基，厭氧培養24 h，再按5%接種量接種于發酵培養基，37℃厭氧培養48 h，14 000 r/min離心5 min，收集上清液，經0.2 μm濾膜過濾除菌后備用。

（2）靶標菌的制備

將大腸埃希氏菌CMCC（B）44103、腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、傷寒沙門氏菌CMCC（B）50071劃線接種于LB固體培養基上37℃培養24h，依次用無菌生理鹽水洗脫菌體，制備菌懸液，并將菌懸液的菌濃度稀釋為106CFU/mL，備用。

將金黃色葡萄球菌MASA、宋內志賀氏菌CMCC（B）51592，單核細胞增生李斯特菌ATCC19114、福氏志賀氏菌CMCC（B）51572和表皮葡萄球菌CMCC26069依次接種于TSA固體培養基上，于37℃條件下培養24 h，依次用生理鹽水洗脫，制備菌濃度為106CFU/mL左右的菌懸液后，備用。

（3）靶標菌平板制備

采用雙層平板法制備靶標菌平板。取15 mL培養基加入到培養皿，凝固后作為下層；取5 mL含2%不同靶標菌菌懸液的培養基加入凝固后的下層培養基上作為上層，待用。

（4）抑菌能力測定

采用牛津杯法測定抑菌活性。將牛津杯垂直放在制備好的不同靶標菌平板上，使其與培養基表面無空隙后，在牛津杯中加入240 μL丁酸梭菌發酵上清液，于37℃條件下培養16～18 h，觀察并測量抑菌圈直徑。每組測定兩個重復。抑菌圈越大，表明抑菌活性越強[9-11]。

1.3.2 優良菌株LXYB-2與初始菌株LXKJ-1的抗逆性比較

（1）丁酸梭菌樣品菌液的制備

將活化菌株LXKJ-1與LXYB-2分別接種至種子培養基中，37℃厭氧培養24 h后，按5%接種量接種至發酵培養基，37℃厭氧培養48 h，發酵培養結束后，3 000 r/min離心10 min，收集菌體，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌兩次后重懸，使菌體濃度為5.0×108CFU/mL，備用。

（2）耐熱性試驗

取上述菌液樣品1mL到含9mL甘油溶液（80%甘油）的試管中，漩渦振蕩充分混勻后，分別置于60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的水浴中處理5 min，置于0℃冰水混合物中冷卻，3000r/min離心10min，收集菌體，PBS洗滌兩次后重懸，采用梯度稀釋平板法測定其活菌數[6-8]。每個樣品重復3次，同時計算存活率，其計算公式如下：

（3）人工胃液耐受性試驗

人工胃液參照2015版《中國藥典》進行配制。

取上述樣品菌液1 mL到9 mL人工胃液中，人工胃液最終pH值調為1.5左右，振蕩混勻，37℃水浴孵育，每隔0.5 h取樣，將經過人工胃液處理后的菌懸液，3 000 r/min離心10 min，PBS洗滌兩次后重懸，梯度稀釋法活菌計數，每個樣品重復3次[9-11]，同時計算存活率。

（4）人工腸液耐受性試驗

人工腸液參照2015版《中國藥典》進行配制。

取上述樣品菌液1 mL到9 mL人工腸液中振蕩混勻，37℃水浴孵育2 h，毎隔0.5 h取樣，3 000 r/min離心10 min，PBS緩沖液洗滌兩次后重懸，采用梯度稀釋法進行活菌計數，每個樣品重復3次[12]，計算存活率。

（5）膽鹽耐受性試驗

在種子培養基中加入不同量的豬膽鹽，使其質量分數分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，混勻，121℃、15 min滅菌后備用。按107CFU/mL接種量分別接種，厭氧培養24 h，觀察菌體生長情況，并用紫外分光光度計測定菌液的OD600nm值，每個樣品重復3次[11，13]。

1.3.3 數據統計與分析

通過Excel 2010對本研究得到的數據進行統計，并計算活菌數的存活率，后利用SPASS19.0軟件進行方差分析，當存在顯著差異時，用Duncan氏多重比較法檢測組間差異性，0.01＜P＜0.05，表示差異顯著；P＜0.01，表示差異極顯著。結果用平均值±標準差表示。并利用Origin Pro 8.0軟件對本研究中部分數據進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 優良菌株LXYB-2與初始菌株LXKJ-1發酵液抑菌活性比較

益生菌作為活菌制劑，對常見致病菌都具有一定的抑菌活性，丁酸梭菌作為活菌制劑的一種，也不例外。優良菌株LXYB-2與出發菌株LXKJ-1發酵液抑菌活性結果見圖1，抑菌圈測量結果見表1。

圖1 菌株LXYB-2與菌株LXKJ-1發酵液抑菌活性比較Fig.1 Comparison of antibacterial activities of fermentation broth of strains LXYB-2 and LXKJ-1

由圖1和表1可知，兩株丁酸梭菌菌株對常見的9種致病菌都具有抑菌活性，通過對兩株菌抑菌直徑的比較，發現兩株菌對單核細胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性對比差異不顯著（P＞0.05），剩余7種均差異性顯著（P＜0.05），且優良菌株LXYB-2對常見的9種致病菌抑制作用比初始菌株LXKJ-1更強，因此優良菌株LXYB-2具有更好的應用前景。

表1 菌株LXYB-2與LXKJ-1發酵液抑菌活性Table 1 Antibacterial activities of fermentation broth of strains LXYB-2 and LXKJ-1

大腸桿菌和沙門氏菌是引起動物腹瀉的主要腸道病原菌，與出發菌株LXYB-1相比，優良菌株LXYB-2對上述常見致病菌表現出更強的抑制活性，大腸埃希氏菌CMCC（B）44103抑菌直徑提高了24.7%；傷寒沙門氏菌CMCC（B）50071抑菌直徑提高了23.99%；鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028抑菌直徑提高了32.6%；腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335抑菌直徑提高了37.6%；說明丁酸梭菌LXYB-2比出發菌株LXYB-1更具有替代抗腹瀉抗生素的潛力。

林秋云等[14]發現，丁酸梭菌對葡萄球菌尤其是對金黃色葡萄球菌具有強烈的抑制作用，但在本試驗中，兩株菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌活性差異不顯著（P＞0.05），究其原因可能是丁酸梭菌代謝產物較為復雜，起到抑菌活性的物質不單一，優良菌株LXYB-2與出發菌株LXYB-1相比較究竟是何種具有抑菌性的代謝產物增加了還需要進一步研究。

丁酸梭菌體外抑菌試驗的抑菌機理，目前公認的使其代謝產生短鏈脂肪酸類，降低生長環境的pH，抑制有害菌生長，減少有害菌在腸道內定殖，還通過營養競爭，抑制了有害菌生長[16]；或代謝物質中含有蛋白類或多肽類物質對有害菌的抑制[8]；本研究中兩株丁酸梭菌對9種常見動物致病菌均具有抑制作用，但經過常壓室溫等離子體（atmospheric and roomtemperature plasma，ARTP）誘變篩選后的優良菌株其抑菌作用更強，可能是由于突變菌株產抑菌活性物質基因的表達量提高了，導致突變菌株產抑菌活性物質能力增強了，究其作用機理卻依然值得進一步探討[15-16]。

2.2 優良菌株LXYB-2與初始菌株LXKJ-1的抗逆性比較結果

2.2.1 耐熱性比較結果

菌株的高溫耐受性，是微生態制劑是否能夠在飼料加工過程中存活下來的一個主要考察指標，耐熱性直接關系到其應用范圍，因此耐熱性考察以及耐熱性菌株的篩選是非常重要的。飼料加工過程溫度與時間一般為85℃，5 min內[17]，實驗組分別按照1.3.2中制備的出發菌株LXKJ-1和優良菌株LXYB-2的菌懸液為對照，對出發菌株LXKJ-1和優良菌株LXYB-2的耐熱性進行比較，兩株菌的高溫耐受性結果分別見表2和表3。

表2 菌株LXKJ-1的高溫耐受性結果Table 2 Results of resistance of strain LXKJ-1 to high temperature

表3 菌株LXYB-2的高溫耐受性結果Table 3 Results of resistance of strain LXYB-2 to high temperature

由表2和表3可知，菌株LXKJ-1與菌株LXYB-2都具有較好的耐熱性，在80℃處理5 min后，活菌數均為4.96×108CFU/mL，活菌數差異性比較不顯著（P＞0.05）；但是隨著溫度的上升，兩株菌高溫耐受性開始下降，90℃條件下處理5 min后活菌數分別為2.45×108CFU/mL和4.12×108CFU/mL，數據分析差異性比較顯著（P＜0.05）。兩株菌分別在90℃和100℃條件下處理5min后，兩株菌株的高溫耐受性存在顯著差異性（P＜0.05），且菌株LXYB-2的存活率較初始菌株分別高了32.4%和17.4%，說明菌株LXYB-2比菌株LXKJ-1具有更好的高溫耐受性。

丁酸梭菌高溫耐受性試驗發現，兩株菌都可以耐受飼料加工過程中的高溫過程，但是隨著加熱溫度的上升，菌體的存活率呈下降狀態，在實際的飼料處理或制粒的過程中，工廠需要縮短熱處理時間，時間過長會造成菌體的大量滅活[18]。

2.2.2 人工胃液耐受性研究結果

動物的胃液屬于酸性環境，一般pH值在2.5～3.0[19]，丁酸梭菌是否能夠進入腸道內定殖和發揮作用，必須經過胃液環境的考驗，而食物在胃中消化時間一般為1～2 h[20-21]，因此，胃液耐受性考察是作為丁酸梭菌應用潛力考察的一個重要指標。分別以按照1.3.2中制備的出發菌株LXKJ-1和優良菌株LXYB-2的菌懸液為對照，比較兩株菌株人工胃液耐受性差異，菌株LXKJ-1的人工胃液耐受性結果見表4，優良菌株LXYB-2人工胃液耐受性結果見表5。

表4 LXKJ-1人工胃液耐受性結果Table 4 Results of resistance of strain LXKJ-1 to artificial gastric fluid

表5 LXYB-2人工胃液耐受性結果Table 5 Results of resistance of strain LXYB-2 to artificial gastric fluid

由表4和表5可知，菌株LXYB-2與菌株LXKJ-1經人工胃液處理2.0 h后，活菌數分別為4.93×108CFU/mL和4.49×108CFU/mL，活菌數差異性分析不顯著（P＞0.05），說明兩株菌株胃液耐受性都較強。菌株LXYB-2經人工胃液處理2.0 h后活菌數變化不明顯為4.93×108CFU/mL，而菌株LXKJ-1活菌數降低10%左右，為4.49×108CFU/mL，說明菌株LXYB-2人工胃液耐受性優于出發菌株LXKJ-1。

2.2.3 人工腸液耐受性研究結果

張媛媛等[23]指出小腸液的pH值為7.5左右，食物通過小腸的時間為1.5 h；實驗按照1.3.2中制備的出發菌株LXKJ-1和優良菌株LXYB-2的菌懸液為對照，出發菌株LXKJ-1人工腸液耐受性結果見表6；優良菌株LXYB-2人工腸液耐受性結果見表7。

由表6和表7可知，菌株LXYB-2與菌株LXKJ-1對人工腸液都具有很好的耐受性，人工腸液處理2.0h，活菌數均為5.0×108CFU/mL，菌株LXYB-2與菌株LXKJ-1的活菌數變化無顯著差異性（P＞0.05），說明菌株LXYB-2與菌株LXKJ-1都可以在腸道內保持較高的存活率。

表6 菌株LXKJ-1人工腸液耐受性結果Table 6 Results of resistance of strain LXKJ-1 to artificial intestinal fluid

表7 菌株LXYB-2人工腸液耐受性結果Table 7 Results of resistance of strain LXYB-2 to artificial intestinal fluid

在模擬胃、腸液耐受性試驗發現，兩株丁酸梭菌都具有非常好的耐受性，但是在實際應用過程中，胃腸道環境、飼料中大量抗生素類物質的添加、高銅高鋅等因素是否都丁酸梭菌的生存繁殖有影響還需要進一步驗證和考察。

2.2.4 膽鹽耐受性研究結果

菌株的特性決定了其腸道膽鹽的耐受性，一般情況下動物腸道內膽鹽的質量分數約為0.03%～0.30%，菌株膽鹽耐受性是影響其在腸道定殖的重要因素[22]。菌株LXKJ-1與LXYB-2的膽鹽耐受性結果見圖2。

圖2 菌株LXKJ-1與LXYB-2膽鹽耐受性比較Fig.2 Comparison of bile salt resistance between strains LXKJ-1 and LXYB-2

由圖2可知，優良菌株LXYB-2與起始菌株LXKJ-1都對膽鹽具有很好的耐受性，但是優良菌株LXYB-2在人工膽鹽濃度0.4%條件下能夠正常生長，而出發菌株LXKJ-1在該濃度下菌株的生長已經受到抑制，兩株菌的人工膽鹽耐受性差異性顯著（P＜0.05），說明菌株LXYB-2比菌株LXKJ-1更具有膽鹽耐受性，可以保證了其可以順利地通過小腸，并最終成功定殖于動物腸道后端。

3 結論

通過對菌株LXYB-2與LXKJ-1的抑菌能力比較得出，兩株菌對單核細胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性對比差異不顯著（P＞0.05），對剩余7種靶標菌的抑制能力均差異性顯著（P＜0.05），且優良菌株LXYB-2對常見的9種致病菌抑制作用比初始菌株LXKJ-1更強。

通過對菌株LXYB-2與LXKJ-1的溫度、人工胃液、人工腸液及膽鹽耐受性的測定和比較得出：菌株LXKJ-1和菌株LXYB-2都具有較好的高溫耐受性，90℃處理5 min，菌株LXYB-2存活率較菌株LXKJ-1高32.4%，差異顯著（P＜0.05）；兩株丁酸梭菌菌株均具有很好的人工胃液、人工腸液耐受性，且差異不顯著（P＞0.05）；菌株LXYB-2與菌株LXKJ-1都對膽鹽具有較好的耐受性，且菌株LXYB-2比菌株LXKJ-1膽鹽耐受性更強，在膽鹽濃度為0.4%時，菌株LXYB-2依然可以正常生長，較菌株LXKJ-1膽鹽耐受濃度提高了0.1%，膽鹽耐受性差異顯著（P＜0.05）。說明優良菌株LXYB-2更具有應用潛力，這為進一步的篩選和挖掘益生菌的應用潛力提供了參考。

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