堿提酸沉法提取薏仁碎米中蛋白質的研究

安家靜，盧紅梅，陳 莉*，賈青慧，楊 新，楊華連

（1.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點試驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學 化學與化工學院，貴州 貴陽 550025）

薏仁米是禾本科植物薏苡的干燥種仁，含有十分豐富的營養(yǎng)成分（如蛋白質、礦物質、粗纖維、氨基酸、維生素[1]等），被譽為“禾本科植物之王”。早在《本草綱目》中就有關于薏仁米的記載，薏仁米可以“健脾益胃，補肺清熱，祛風勝濕，養(yǎng)顏駐容，輕身延年”。實驗研究表明，薏苡仁多糖具有抗氧化[2]、降血糖作用[3]，薏苡仁酯具有防治腫瘤作用[4]、薏苡仁油具有鎮(zhèn)痛止血[5]等作用，是一種集營養(yǎng)、保健、美容等功效于一身的食療佳品。王靈芝等[6]測得薏苡中蛋白總含量為14.17%，清蛋白占總蛋白含量的1.43%、球蛋白占6.20%、醇溶蛋白占44.74%、谷蛋白占37.38%，并對氨基酸進行了測定，除色氨酸外，共檢測到15種氨基酸，人體所需的必需氨基酸、半必需氨基酸均檢出。傅新征等[7]對薏苡淀粉的顆粒形貌、理化性質等進行了較為深入的研究，結果顯示薏苡淀粉顆粒形貌為多邊形、球形，并且表面光滑完整，晶體結構屬C型；薏苡淀粉糊凝沉速度較為緩慢，強酸強堿等外部條件會使其凝沉速度降低。張棟霞等[8]對薏苡仁油的組成成分進行了分析，共有35種成分被檢測到，并對其中的18種成分進行了鑒定，其中油酸占46.40%、棕櫚油占12.26%、亞油酸占37.41%、硬脂酸占2.53%，84%為不飽和脂肪酸。

薏仁米在加工成精米的過程中去掉的外殼、種皮和胚（米糠）是薏仁米加工的主要副產品，其中含米糠蛋白、米糠油、米糠多糖、米糠植酸鈣等多種營養(yǎng)成分，具有較高的保健開發(fā)價值，并且目前大部分薏仁米加工企業(yè)生產設備比較落后，技術不完善，導致產品的碎米率很高，這些大量的碎米和糠殼等副產物僅作為低值產品直接處理銷售，綜合利用不充分，這在很大程度上制約了薏仁米進一步的市場拓展和產品開發(fā)，也給薏仁米生產加工企業(yè)造成了較大損失。目前國內外對薏仁米的研究主要集中在營養(yǎng)分析、加工利用、活性成分等方面，對薏仁碎米及薏米糠中蛋白提取的研究較少，因此對薏仁米中的蛋白進行提取并進行相關研究意義重大。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂薏仁碎米：來源于貴州興仁縣某食品有限公司，由實驗室自制。用萬能粉碎機將薏仁碎米粉碎后盛入大燒杯中，用30～60 ℃沸程的石油醚按1∶3（g∶mL）比例在室溫下攪拌脫脂3 h，過濾，石油醚沖洗，于通風櫥中風干，在4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

濃鹽酸：重慶川江化學試劑廠；氫氧化鈉、硼酸：天津市永大化學試劑有限公司；甲基紅、亞甲基藍：天津市優(yōu)譜化學試劑有限公司；石油醚：天津市瑞金特化學品有限公司；硫酸銅：重慶北碚精細化工廠；酒石酸鉀鈉：上海艾博添加劑有限公司；濃硫酸：重慶川東化工（基團）有限公司；以上試劑均為分析純。牛血清白蛋白（純度＞98%）：上海哈靈生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SH220石墨消解儀、K9840自動凱氏定氮儀：濟南海能儀器股份有限公司；220 V.AC 1 000 W萬用電爐：天津市泰斯特儀器有限公司；DHG-9075AE智能型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海瑯玕試驗設備有限公司；HH-b型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州奧華儀器有限公司；FA2004N精密電子天平、722S可見分光光度計：上海菁海儀器有限公司；ZD-2A自動電位滴定儀：上海大普儀器有限公司；CJJ-781磁力加熱攪拌器：城西曉陽電子儀器廠；FW-80萬能粉碎機：上海仕元科學器材有限公司；80-2電動離心機：常州澳華儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 薏仁蛋白提取工藝流程[4]

脫脂薏仁碎米→堿液浸泡提取→離心→上清液等電點沉淀→靜置、離心→沉淀物→水洗至中性→真空干燥→薏仁米糠蛋白

1.3.2 各指標的測定

（1）水分含量測定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中的直接干燥法對水分含量進行測定。

（2）灰分含量測定

參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》中的高溫灰化法對灰分含量進行測定。

（3）粗蛋白含量測定

參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法對蛋白質含量進行測定。

（4）粗脂肪含量測定

參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法對粗脂肪含量進行測定。

（5）粗纖維含量測定

參照GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》對粗纖維含量進行測定。

（6）蛋白含量測定

采用雙縮脲法[7]對溶液中蛋白含量進行測定。

雙縮脲試劑的配制：在500mL蒸餾水中，溶入1.5g硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0 g酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O），邊攪拌邊加入10%NaOH溶液300mL，繼續(xù)加水至1000mL。

標準曲線的繪制：用0.05mol/LNaOH溶液配制10mg/mL牛血清白蛋白溶液，取6只編號的10 mL試管，依次加入牛血清白蛋白標準溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，用蒸餾水補足至1 mL，依次加入4 mL雙縮脲試劑，在漩渦混勻器上混勻1 min，室溫條件下放置30 min，參比溶液為蒸餾水，在波長540 nm處比色測定，以牛血清白蛋白質量濃度（x，mg/mL）為橫坐標，吸光度值A（y）為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明，標準曲線方程為y=0.05446x-0.00024，相關系數(shù)R2=0.999 66。

樣液測定：取經(jīng)堿法或酶法提取蛋白之后的樣液0.5mL，加水補充至1 mL，加入雙縮脲試劑4 mL，漩渦混勻器混勻1 min，室溫條件下放置30 min，于波長540 nm處比色測定，對照標準曲線方程求得樣品溶液蛋白質的濃度。

1.3.3 堿提酸沉法提取薏仁碎米蛋白

借鑒前人采用此法分離提取植物蛋白的研究成果[9-11]，確定影響蛋白提取率的重要因素，以薏仁碎米蛋白提取率為指標，對影響薏仁碎米蛋白提取效果的4個因素：料液比、堿提溫度、堿提時間、堿提pH進行單因素試驗，在單因素試驗的基礎之上，用Box-Behnken試驗設計對4個因素進行優(yōu)化，確定堿提酸沉法提取薏仁碎米蛋白的最佳工藝條件，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素水平與編碼Table 1 Factor and levels of response surface methodology

1.3.4 薏仁碎米蛋白等電點的確定

使用試驗所得的最佳提取條件提取薏仁碎米蛋白，取蛋白提取的上清液20 mL，用15%HCl調節(jié)pH值為4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0，4 000 r/min離心15 min，采用雙縮脲法測出酸沉、離心后中上清液的蛋白質質量濃度，以pH為橫坐標，蛋白質質量濃度（mg/mL）為縱坐標，繪出蛋白質質量濃度-pH的關系圖。

2 結果與分析

2.1 薏仁碎米基本組成成分分析

薏仁碎米中主要營養(yǎng)成分如表2所示，薏仁碎米中粗蛋白含量為15.71%，與常見蛋白質食品進行比較，其中雞蛋蛋白質平均含量為12.33%[8]，唐偉英等[9]采用電位滴定法測定牛乳中蛋白質含量為2.956%，常鑫[10]測定70個品種大豆蛋白平均值為40.17%，毛曉英[11]測得核桃蛋白質含量為16.66%，面粉含蛋白質10%～11%，稻米含蛋白質8%～9%，一般瘦肉類、魚蝦類及軟體動物類食品中蛋白質含量為15%～20%[12]。由此可知，薏仁碎米中蛋白含量和核桃、瘦肉、魚蝦類相當，高于雞蛋、牛乳、面粉、稻米，低于大豆，是優(yōu)質的植物蛋白類食品，具有極大的開發(fā)利用價值。

表2 薏仁碎米營養(yǎng)組成成分Table 2 Constituent compositions of broken coix rice

2.2 薏仁碎米蛋白等電點確定

薏仁碎米蛋白在不同pH條件下沉淀后的蛋白質質量濃度如圖1。

圖1 薏仁碎米蛋白等電點測定結果Fig.1 Isoelectric point of broken myotonin rice protein

從圖1可以看出，薏仁碎米蛋白等電點為pH5.2，與尚宏麗等[13]報道的pH 5.0相似。

2.3 堿提酸沉法提取薏仁碎米蛋白

2.3.1 料液比對薏仁碎米蛋白提取率的影響

在堿提pH為10，堿提溫度為40℃，堿提時間為4 h條件下，不同料液比對薏仁碎米蛋白提取率的影響如圖2所示。

從圖2可知，料液比在1∶6～1∶12（g∶mL）范圍內，薏仁碎米蛋白提取率隨著料液比的增大而增大，在料液比為1∶12（g∶mL）時，提取率最高達36.03%，隨著料液比的繼續(xù)增大，蛋白提取率呈下降趨勢。在料液比較小時，蛋白質不能較為充分的溶解，提取率低；當料液比過大時，蛋白沉淀的效果相對較差，導致?lián)p失較大，同時所需設備容積大，成本相應增加[14]。堿法提取薏仁碎米蛋白提取率的最佳料液比是1∶12（g∶mL），選擇料液比為1∶10、1∶12、1∶14（g∶mL）三個水平進行響應面優(yōu)化試驗。

圖2 料液比對薏仁碎米蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on protein extraction rate of broken coix rice

2.3.2 堿提pH對薏仁碎米蛋白提取率的影響

在料液比為1∶12（g∶mL），堿提溫度為40 ℃，堿提時間為4 h條件下，不同堿提pH對薏仁碎米蛋白提取率的影響如圖3所示。

圖3 提取pH對薏仁碎米蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of alkali-extracting pH value on protein extraction rate of broken coix rice

從圖3可知，隨著pH的升高，薏仁碎米蛋白提取率呈較快的增加趨勢，當pH超過10.0之后，蛋白提取率呈下降趨勢，當pH=10.0時，薏仁碎米蛋白提取率達42.52%。當pH超過10.0之后，薏仁碎米蛋白提取率減低，是因為較高的pH會使蛋白質發(fā)生變性或者降解[15]。堿法提取薏仁碎米蛋白提取率最佳的pH 10.0，選取pH為9.5、10.0、10.5三個水平進行響應面優(yōu)化試驗。

2.3.3 堿提溫度對薏仁碎米蛋白提取率的影響

在料液比為1∶12（g∶mL），堿提pH為10，堿提時間為4 h條件下，不同堿提溫度對薏仁碎米蛋白提取率的影響如圖4所示。

圖4 提取溫度對薏仁碎米蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on protein extraction rate of broken coix rice

從圖4可知，當提取溫度為25～35℃時，蛋白提取率增長較快，溫度為35～45℃時，蛋白提取率增長較慢，當溫度為45℃時，蛋白提取率為41.62%。當溫度超過45℃之后，隨著溫度的繼續(xù)升高，蛋白提取率呈下降趨勢，當溫度過高的時候，蛋白溶液的黏度相應增大，從而使蛋白分子的運動速率降低[16]，并且較長時間的加熱，會使部分蛋白質發(fā)生變性，從而使提取率降低[17]。堿法提取薏仁碎米蛋白提取率最佳的溫度為45℃，選取40℃、45℃、50℃三個水平進行響應面優(yōu)化試驗。

2.3.4 堿提時間對薏仁碎米蛋白提取率的影響

在料液比為1∶12（g∶mL），堿提pH為10，堿提溫度為40 ℃的條件下，不同堿提時間對薏仁碎米蛋白提取率的影響如圖5所示。

圖5 提取時間對薏仁碎米蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on protein extraction rate of broken coix rice

從圖5可知，在提取時間1～4 h內，蛋白提取率隨時間的延長逐漸增大，當提取時間超過4 h后，蛋白提取率變化不大。當提取時間4 h時，蛋白提取率為34.82%。提取時間較短時，堿性溶液和原料沒有充分接觸，導致薏仁碎米蛋白和其他組分的分離較困難，提取率偏低[17]。堿提薏仁碎米蛋白提取率最佳的時間為4 h，選取3 h、4 h、5 h三個水平進行響應面優(yōu)化試驗。

2.3.5 響應面試驗及方差分析

根據(jù)單因素試驗結果，采用Box-Behnken中心組合設計原理，設計4因素3水平的響應面優(yōu)化試驗，對影響薏仁碎米蛋白提取率的4個因素：堿提pH、堿提溫度、堿提時間、料液比進行響應面試驗分析，結果見表3。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

表4 二次多項式模型的方差分析和模擬的失擬性試驗Table 4 Analysis of variance for response surface quadratic model and lack of fit test

續(xù)表

用Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得堿提pH（A）、堿提溫度（B）、堿提時間（C）、料液比（D）與蛋白質提取率關系的二次多項回歸方程為：

由表3、表4可知，對所得模型進行失擬性檢驗、方差分析顯示：該模型的一次項和交互項顯著（P＜0.05），平方項和立方項不顯著（P＞0.05）。在本試驗所涉及范圍內，模型的P值=0.000 2，模型極顯著（P＜0.01）；失擬項=0.384 6，失擬項不顯著，該方程合理可行。由方差分析表可知，堿提pH、堿提溫度對結果影響極顯著（P＜0.01），堿提時間對結果影響顯著（P＜0.05），料液比對結果影響不顯著（P＞0.05）；在交互作用中，堿提pH和堿提溫度交互作用顯著，其他交互作用均不顯著；在二次項中，堿提pH、堿提溫度、堿提時間、料液比對結果影響極顯著（P＜0.01）。

2.3 .6響應曲面分析

響應面圖直觀的反映了各因素對薏仁碎米蛋白提取率的影響，結果見圖6。以薏仁碎米蛋白提取率最大為目標，對各因素在試驗范圍內進行最優(yōu)化處理，得到最佳提取工藝為料液比1∶12（g∶mL）、堿提pH 10.1、堿提溫度47.2 ℃、堿提時間4 h，理論蛋白提取率最大41.11%，在此條件下進行驗證試驗，得薏仁碎米蛋白平均提取率為38.75%。

圖6 各因素交互作用對薏仁碎米蛋白提取率影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interactions between each factors on extraction ratio of protein from broken coix rice

3 結論

大量的碎米和糠殼等副產物僅作為低值產品直接處理銷售，綜合利用不充分，制約了薏仁米資源進一步的市場拓展和產品開發(fā)，也給薏仁米生產加工企業(yè)造成了較大損失。而此方法能最大限度的提取出碎米中的蛋白，為貴州薏仁米的發(fā)展提供最重要的依據(jù)。堿提酸沉法提取薏仁碎米蛋白的最佳提取工藝為料液比1∶12（g∶mL）、堿提pH 10.1、堿提溫度47.2℃、堿提時間4 h，理論蛋白提取率最大41.11%，實際薏仁碎米蛋白平均提取率為38.75%。對比堿提酸沉法和酶法兩種提取方法，提取率相差不多，堿提酸沉法所需溫度低，但耗時長，酶法提取時間短，但所需溫度高，并且酶的價格相對昂貴，具體哪種方法更適用于工業(yè)化生產，還需進一步考量其能量損耗等經(jīng)濟狀況。

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