1株產(chǎn)類胡蘿卜素鹽盒菌的分離鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

高文庚，于慧瑛，李 新*

（運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000）

類胡蘿卜素是廣泛分布于動(dòng)植物體內(nèi)的天然色素，具有抗氧化、抗癌、增強(qiáng)免疫力、控制前列腺疾病和退行性黃斑衰退癥等功能，被廣泛應(yīng)用于藥品、保健食品、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑等領(lǐng)域[1-4]。多數(shù)鹽盒菌呈不同程度的紅色，研究發(fā)現(xiàn)，鹽盒菌菌體內(nèi)富含C45或C50高碳類胡蘿卜素，且結(jié)構(gòu)中具有更多共軛雙鍵，在抗氧化活性研究方面更具科學(xué)研究?jī)r(jià)值和開發(fā)利用價(jià)值[5]。此外，該類微生物所產(chǎn)色素主要包括菌紅素及其衍生物、類胡蘿卜素、番茄紅素等[6-7]。

鹽盒菌屬是一類只能在高鹽環(huán)境中生存的極端環(huán)境微生物，其最適生長(zhǎng)鹽濃度為2.5～5.2 mol/L，多生存于鹽湖、鹽田、腌制食品等鹽域環(huán)境中，具有獨(dú)特的種群分布與群落結(jié)構(gòu)[8]。由于生存環(huán)境特殊，嗜鹽古菌形成了獨(dú)特的代謝機(jī)制，可產(chǎn)生胞外淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶等多種嗜鹽酶類[9-10]，其中一些酶具有良好的穩(wěn)定性，可以耐受較為苛刻的外界條件[11]。另外，一些嗜鹽菌對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及辣椒疫霉菌等具有拮抗作用[12-13]。由于鹽盒菌代謝方式及產(chǎn)物的特殊性，近年來(lái)備受關(guān)注，成為研究的熱點(diǎn)[14]。目前，對(duì)于鹽盒菌研究，主要集中在菌種分離篩選、色素組分分析及菌紅素生物學(xué)特性研究方面[5-7]，而對(duì)于產(chǎn)類胡蘿卜素鹽盒菌的報(bào)道相對(duì)較少，研究鹽盒菌生長(zhǎng)及發(fā)酵特性對(duì)于天然類胡蘿卜素工業(yè)化生產(chǎn)顯得尤為重要。

本研究從運(yùn)城鹽湖中分離獲得一株發(fā)酵液呈橘紅色的鹽盒菌菌株G14，擬采用16S rRNA基因序列分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察與生理生化特性分析等，對(duì)其進(jìn)行分類鑒定，并對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，以期通過(guò)最佳條件進(jìn)行菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，為后續(xù)利用該菌進(jìn)行類胡蘿卜素發(fā)酵生產(chǎn)等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株G14：分離自運(yùn)城鹽湖的黑泥樣本，分離純化后4℃保存。

酸水解酪蛋白、酵母浸粉、蛋白胨等常規(guī)生化試劑：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DNA提取純化試劑盒：北京索萊寶公司；DNAMarker、EXTaqDNA聚合酶（5U/μL）、引物合成（正向引物：5'-ATTCCGGTTGATCCTGC-3'，反向引物：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3）'、pMD18-T載體：大連TaKaRa公司。

高鹽培養(yǎng)基：酸水解酪蛋白6 g/L，檸檬酸鈉3 g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨5g/L，無(wú)水MgSO49.76g/L，KCl2g/L，NaCl 210～290 g/L，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.5～8.0，121 ℃滅菌20 min后備用。固態(tài)培養(yǎng)基添加瓊脂2 g/100 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；T100聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀：美國(guó)Bio-Rad公司；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；LDZX-50K立式壓力蒸氣滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；HZP-150型全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；UV-6000PC紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱：上海飛龍儀表電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株G14的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特性

將分離純化的G14菌株劃線接種于固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)7 d，觀察單菌落形態(tài)特征。革蘭氏染色觀察個(gè)體形態(tài)，并參照文獻(xiàn)[15]對(duì)其生理生化特征進(jìn)行研究。

1.3.2 菌株G14的16S rRNA基因序列分析

DNA提取及擴(kuò)增體系參照文獻(xiàn)[16]的方法。采用通用基因組DNA提取試劑盒，提取菌株G14基因組，以總DNA為模板，采用極端嗜鹽古菌特異性引物進(jìn)行16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增。正向引物：5'-ATTCCGGTTGATCCTGC-3'，反向引物：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3'。PCR反應(yīng)體系（20μL）：無(wú)菌水13.2μL，10×PCRExTaqbuffer2.0μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mixtures 1.6 μL，ExTaq 聚合酶 0.2 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 1 min；95℃變性 30 s，52℃退火 1 min，72℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后回收純化，送北京三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選擇同源性較高的相關(guān)序列，利用Clustal W1.8、MEGA 5.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)及分析，構(gòu)建菌株G14的系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定其分類學(xué)地位。

1.3.3 菌株G14的培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)

分別測(cè)定光照處理、高鹽培養(yǎng)基中NaCl質(zhì)量濃度、初始pH及培養(yǎng)溫度對(duì)菌株G14生長(zhǎng)的影響。

在裝有150 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，分別接入經(jīng)37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d的種子液2%（V/V），一定溫度條件下160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，定時(shí)取樣測(cè)定培養(yǎng)液OD600nm值，比較不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株G14生長(zhǎng)的影響。單因素試驗(yàn)設(shè)定分別為遮光黑暗培養(yǎng)、光照培養(yǎng)（光照強(qiáng)度1833lx），NaCl質(zhì)量濃度分別為0.21 g/mL、0.23 g/mL、0.25 g/mL、0.27 g/mL、0.29 g/mL，初始pH分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，培養(yǎng)溫度分別為30℃、35℃、40℃、45℃。

1.3.4 菌株G14培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取培養(yǎng)溫度（A）、初始pH值（B）、培養(yǎng)基NaCl質(zhì)量濃度（C），采用3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)對(duì)G14菌株培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，因素與水平見表1。

表1 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for culture conditions optimization

1.3.5 菌株生長(zhǎng)量及類胡蘿卜素含量測(cè)定

生長(zhǎng)量測(cè)定：培養(yǎng)過(guò)程中1d取樣3次，每次5mL，利用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm條件下測(cè)定菌液的OD600nm值[17]，共培養(yǎng)7 d。

類胡蘿卜素含量測(cè)定：參照文獻(xiàn)[5]方法將培養(yǎng)7 d菌液100 mL離心收集菌體后，10%滅菌NaCl溶液懸洗3遍。加5 mL丙酮充分振蕩提取后離心，取上清液在波長(zhǎng)475 nm處測(cè)定OD475nm值，類胡蘿卜素含量計(jì)算公式如下：

式中：X為類胡蘿卜素含量，μg/mL；A為最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度值；D為浸提液稀釋倍數(shù)；V1為丙酮添加量，mL；V2為發(fā)酵液體積，mL；E為類胡蘿卜素的消光系數(shù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，運(yùn)用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（data processing system，DPS）統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株G14鑒定

2.1.1 菌株G14形態(tài)學(xué)及生理生化特征鑒定結(jié)果

菌株G14在高鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈橘紅色、極具光澤，中央突起、邊緣平整，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，菌體細(xì)胞呈球狀。菌株G14生理生化特征見表2。

由表2可知，菌株G14能產(chǎn)生淀粉水解酶、纖維素酶、明膠水解酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶及苯丙氨酸脫氫酶等；不能產(chǎn)生氧化酶、蛋白酶及吲哚等；能夠還原硝酸鹽，產(chǎn)生H2S，甲基紅和V-P實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為陰性；菌株G14能夠利用葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖、D-木糖作為碳源，在鹽質(zhì)量濃度0.1～0.3 g/mL、pH4～10范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)。

2.1.2 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，凝膠成像結(jié)果見圖1。

由圖1可知，擴(kuò)增得到基因片段凝膠電泳條帶單一，均有明顯亮帶，與Marker條帶比較發(fā)現(xiàn)，目的基因片段大小約為1 500 bp左右。測(cè)序結(jié)果表明，菌株G14的16S rRNA基因序列為1 420 bp，兩者相符。

由于16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系推斷在嗜鹽古菌種級(jí)以上分類單元的界定中具有較強(qiáng)的分辨力[18]，將基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，序列號(hào)為JN112004。采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2。

圖2 基于16S rRNA基因序列采用鄰接法構(gòu)建的菌株G14的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain G14 constructed by neighborjoining method based on 16S rRNA gene sequences

由圖2可知，與菌株G14同源性最高的是Haloarcula argentinensisJCM 9737，相似度最高達(dá)97.3%，具有較近的親緣關(guān)系，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果和生理生化特征，鑒定其為鹽盒菌屬（Haloarculasp.）。

2.2 菌株G14培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)

2.2.1 光照對(duì)菌株G14生長(zhǎng)的影響

圖3 光照對(duì)菌株G14生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of light on the growth of strain G14

由圖3可知，光照對(duì)于菌株生長(zhǎng)的延滯期、對(duì)數(shù)期均有較大的影響。在相同的培養(yǎng)條件下，光照可明顯縮短菌株G14的延滯期，由40 h縮短至20 h；培養(yǎng)40 h后兩種處理均進(jìn)入對(duì)數(shù)期，但處于光照環(huán)境中菌株G14的菌體生長(zhǎng)量顯著高于黑暗環(huán)境（P＜0.05）；培養(yǎng)114 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，短于黑暗培養(yǎng)的138 h，并且在70 h后菌液有淡紅色出現(xiàn)，而后者培養(yǎng)液始終呈黃色。進(jìn)入穩(wěn)定期后兩種處理菌液的OD600nm值沒有顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明光照對(duì)菌體生長(zhǎng)繁殖速度及類胡蘿卜素產(chǎn)生非常重要，但卻對(duì)最終的總菌體量沒有顯著影響（P＞0.05）。

2.2.2 NaCl質(zhì)量濃度對(duì)菌株G14生長(zhǎng)的影響

圖4 不同的NaCl質(zhì)量濃度對(duì)菌株G14生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of different NaCl mass concentration on the growth of strain G14

由圖4可知，培養(yǎng)基NaCl質(zhì)量濃度對(duì)菌株G14的生長(zhǎng)影響較大。NaCl質(zhì)量濃度為0.21～0.25g/mL時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化，培養(yǎng)液OD600nm值的變化趨勢(shì)基本一致，其中NaCl質(zhì)量濃度為0.23g/mL時(shí)，對(duì)數(shù)期菌體生長(zhǎng)速率最大，進(jìn)入穩(wěn)定期后菌液的OD600nm值相比較于其他質(zhì)量濃度大，且差異顯著（P＜0.05）。而NaCl質(zhì)量濃度為0.21 g/mL和0.25 g/mL的條件下，培養(yǎng)液OD600nm值無(wú)顯著差異（P＞0.05）。NaCl質(zhì)量濃度為0.23 g/mL時(shí)菌株G14生長(zhǎng)效果最好。當(dāng)培養(yǎng)基NaCl質(zhì)量濃度繼續(xù)升高，菌體生長(zhǎng)受到抑制，菌體對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率越低，進(jìn)入穩(wěn)定期越遲，并且穩(wěn)定期培養(yǎng)液中菌體濃度越低。因此，NaCl質(zhì)量濃度0.23 g/mL時(shí)為宜。

2.2.3 初始pH值對(duì)菌株G14生長(zhǎng)的影響

圖5 不同的初始pH值對(duì)菌株G14生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of the different initial pH values on the growth of strain G14

由圖5可知，初始pH值為7.0的培養(yǎng)液中對(duì)數(shù)期菌體生長(zhǎng)速率最大，穩(wěn)定期菌液OD600nm值極顯著高于其他水平（P＜0.01）。當(dāng)pH過(guò)高或過(guò)低，菌體生長(zhǎng)都會(huì)受到抑制。初始pH值為6.0時(shí)延滯期明顯延長(zhǎng)，穩(wěn)定期開始時(shí)間和穩(wěn)定期菌體濃度與pH 8.0時(shí)幾乎一致，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。pH 8.0與pH 7.0條件下菌體生長(zhǎng)量變化趨勢(shì)基本一致，但各階段生物量均低于后者。隨著pH升高，菌株G14生長(zhǎng)各階段均受到影響，至初始pH為10.0時(shí)生長(zhǎng)幾乎完全限制。因此初始值pH7.0時(shí)為宜。

2.2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株G14生長(zhǎng)的影響

圖6 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株G14生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of the different culture temperature on the growth of strain G14

由圖6可知，培養(yǎng)溫度對(duì)于菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期影響較大。在30～45℃溫度范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)溫度的上升，菌體培養(yǎng)的延滯期縮短，對(duì)數(shù)期菌體生長(zhǎng)速率增大，進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間提前，但進(jìn)入穩(wěn)定期后40℃培養(yǎng)OD600nm值較高，與30℃有顯著差異（P＜0.05），其他3個(gè)溫度水平基本一致，未出現(xiàn)顯著差異（P＞0.05）。因此，培養(yǎng)溫度40℃為宜。

2.3 菌株G14培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮各因素對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，采取光照培養(yǎng)，以O(shè)D600nm值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取培養(yǎng)溫度（A）、初始pH值（B）以及NaCl質(zhì)量濃度（C）為評(píng)價(jià)因素，應(yīng)用3因素3水平L9（33）進(jìn)行正交試驗(yàn)，培養(yǎng)140 h測(cè)定OD600nm值，從而進(jìn)一步確定最佳培養(yǎng)條件。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for culture conditions optimization

由表3可知，對(duì)菌株生長(zhǎng)影響因素由大到小的順序依次為B＞A＞C，即初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)影響最大，培養(yǎng)溫度次之，NaCl質(zhì)量濃度影響最小。由正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析可以得出菌株G14生長(zhǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)條件組合為A3B2C2，即培養(yǎng)溫度43℃、初始pH 7.0、NaCl質(zhì)量濃度0.23 g/mL。在此優(yōu)化培養(yǎng)條件下，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)液OD600nm值達(dá)到2.24。測(cè)定此時(shí)培養(yǎng)液類胡蘿卜素產(chǎn)生量為0.65 mg/L。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表4可知，初始pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)有極顯著影響（P＜0.01），而培養(yǎng)溫度及NaCl質(zhì)量濃度在試驗(yàn)設(shè)定水平范圍內(nèi)對(duì)菌體生長(zhǎng)沒有顯著影響（P＞0.05）。

3 結(jié)論

試驗(yàn)對(duì)分離自運(yùn)城鹽湖黑泥樣品中的一株產(chǎn)生類胡蘿卜素菌株G14進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析，發(fā)現(xiàn)該菌屬于鹽盒菌屬（Haloarculasp.），為極端嗜鹽古菌。并采用單因素分析及正交試驗(yàn)對(duì)菌株培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得出菌株G14的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度43℃，NaCl質(zhì)量濃度為0.23 g/mL，初始pH值為7.0。在該優(yōu)化條件下，培養(yǎng)液OD600nm值達(dá)到2.24，類胡蘿卜素產(chǎn)量為0.65 mg/L。該研究結(jié)果對(duì)菌株G14的菌體大規(guī)模培養(yǎng)及高鹽發(fā)酵代謝產(chǎn)物開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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