重組大腸桿菌E.coliBL21/pET28a(+)-mle產蘋果酸乳酸酶發酵條件的優化

胡蘭蘭，田亞楠，陳福生，張秀艷*

（華中農業大學 食品科技學院，湖北 武漢 430070）

果酒中適量的酸能平衡酒的苦澀味，使酒感醇厚爽口；過高則會造成酒味酸澀、酒體粗糙、出現酒色失光、渾濁等現象[1-2]，而一些發酵果酒的原料多具有較高的酸度[3]。降低果酒的酸度是目前果酒釀造中研究的重點。目前國內外對果汁及果酒進行降酸方法有物理降酸法[4-5]、化學降酸法[6-7]、生物降酸法。生物降酸法主要包括主要包括二氧化碳浸漬發酵、蘋果酸-酒精發酵（malo-alcohol fermentation，MAF）[8]和蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）[9-13]，蘋果酸-乳酸發酵是葡萄酒生物降酸的主要方法。

蘋果酸-乳酸發酵（簡稱蘋乳發酵）是在乳酸菌的作用下將果酒中酸澀的L-蘋果酸脫羧基轉化成柔和的L-乳酸，并產生CO2[14]，從而達到降低果酒酸度的目的。蘋乳發酵不僅可以降低生果酒的酸澀味與粗糙感，使之變得圓潤、柔和，同時也可以提高果酒的品質和微生物穩定性[15-18]，果酒一般都需要進行蘋乳發酵。蘋果酸乳酸酶（malolactic enzyme，MLE）簡稱蘋乳酶，是催化蘋乳發酵的關鍵酶。蘋乳酶的酶活力決定著蘋乳發酵過程是否能正常進行。然而，由于果酒的低pH值，高含量SO2，高酒精度等因素而造成乳酸菌生長緩慢，蘋乳酶產量少、酶活力低，從而導致蘋乳發酵遲緩，產生不良代謝產物的前提物質，如生物胺、氨基甲酸乙酯等，同時也易造成果酒的腐敗，甚至引發生物危害[19]。

針對上述問題，國內外學者開展了一系列的研究，如向發酵液中加入蘋乳酶[20]，向發酵液中加入直投式發酵劑、通過細胞融合或利用基因工程等手段構建降酸酵母[21]，但果酒中蘋果酸的轉化率都不高。這可能是因為蘋乳酶不能很好地適應果酒的環境而失活，因為蘋乳酶最適反應pH值為5.8～6.0[22]，而果酒環境的pH值一般為3.5～3.8[23]。

因此本研究對前期構建的分泌表達蘋乳酶的重組大腸桿菌E.coliBL21/pET28a（+）-mle的發酵條件（誘導劑濃度、培養基初始pH值、誘導溫度、誘導時間）進行優化，確定最優培養條件，為后續蘋乳酶的酶學性質研究和酶學性質改造奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

重組大腸桿菌：含pET28a（+）-mle重組質粒的E.coli BL21（DE3）：由本實驗室構建。

1.1.2 試劑

異丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogaLactoside，IPTG）（純度99%），煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicoti namide adenine dinucleotide，NAD+）：美國Sigma公司；卡那霉素（100 mg/mL）：北京索萊寶科技有限公司；L-乳酸檢測試劑盒：法國Biosentec公司。

1.1.3 培養基

LB培養基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，調節pH至7.0左右，加無菌水定容至1 L，121℃滅菌20 min。

5×M9鹽溶液：用去離子水溶解混合鹽（Na2HPO·47H2O 64 g，K2HPO415 g，NaCl 2.5 g，NH4Cl 5.0 g）后定容至1 L。

M9培養基：1 mol/L的硫酸鎂0.1mL，1 mol/L的氯化鈣2 mL，5×M9鹽溶液200 mL，分別于121 ℃滅菌20 min，20%的葡萄糖溶液20 mL（115℃滅菌30 min），然后將4種溶液在無菌條件下混合，用無菌水定容至1 L。

發酵培養基：在M9培養基中加入1%的L-蘋果酸。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-IF超凈工作臺：蘇中凈化設備有限公司；BL-2200H型電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；GI80TR型高壓蒸汽滅菌鍋：美國致微儀器有限公司；pHS-3C型數字酸度計：上海日島科技有限公司；SZ-93自動雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠；UV741型可見紫外分光光度計：惠普上海分析儀器有限公司；TS-211C大容量全溫恒溫搖床：上海晶壇儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分泌表達蘋乳酶的大腸桿菌的誘導表達

菌種活化：用接種環挑取單克隆含pET28a（+）-mle的E.coliBL21的重組菌接種到10 mL的LB培養基中，37℃、200 r/min過夜振蕩培養，活化菌株。

誘導表達：將活化的種子液以1%的接種量接入裝液量為40 mL/250 mL的發酵培養基中，于37℃、200 r/min振蕩培養，當菌體生長密度達到0.8左右（OD600nm）時，添加IPTG進行誘導表達。

1.3.2 發酵液中乳酸含量的分析

乳酸菌以果酒中的L-蘋果酸為底物，在蘋乳酶的催化下轉化成L-乳酸和CO2，蘋乳酶表達量越高，則L-乳酸的產量越高。因此通過檢測發酵液中L-乳酸的產量的高低，從而間接分析蘋乳酶表達量的高低。

L-乳酸試劑盒檢測原理：

L-乳酸（鹽）+NAD+—L-LDH→丙酮酸鹽+NADH+H+

丙酮酸鹽+L-谷氨酸鹽-GPT→L-丙氨酸+2-酮戊二酸

NADH的量和L-乳酸的量呈正比關系。

在含1%L-蘋果酸的M（9pH 6.0）培養基中，誘導表達蘋乳酶，發酵液經5 000 r/min離心5 min。在1 mL上清液中加入終濃度為1 mmol/L的NAD+，0.5 mmol/L的Mn2+，37 ℃反應1 h，取100 μL的反應液體，用L-乳酸檢測試劑盒檢測其L-乳酸含量。具體參見LABARRE C等[24]的方法。

1.3.3 單因素試驗

采用單因素輪換法，在誘導表達條件（同1.3.1）的基礎上，分別考察IPTG濃度（0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8 mmol/L和1 mmol/L）、培養基初始pH值（5.0、5.3、5.6、5.8、6.0、6.5、7.0）、誘導溫度（25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃）和誘導時間（0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h）對重組大腸桿菌分泌蘋乳酸酶的影響，以未誘導的含pET28a（+）-mle的E.coliBL21發酵液為空白對照。

1.3.4 正交試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，以L-乳酸含量（Y）為評價指標，選取誘導時間（A）、誘導溫度（B）、初始pH值（C）和IPTG濃度（D）4個因素進行L9（34）正交試驗設計，正交試驗因素水平見表1。

表1 發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.5 數據分析

所得全部的試驗數據結果均采用SAS軟件（SAS Institute，2000）的ANOVA進行統計分析，采用Microsoft Excel 2010軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 IPTG濃度對分泌表達蘋乳酶的影響

考察了IPTG濃度對重組大腸桿菌分泌表達蘋乳酸的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，隨著IPTG濃度在0～0.6 mmol/L范圍內增加，L-乳酸產量逐漸增大，即蘋乳酶的表達量逐漸增加；當IPTG的濃度為0.6 mmol/L時，發酵上清液中L-乳酸產量最大；繼續增加IPTG濃度，L-乳酸的產量開始下降，可能是因為高濃度的IPTG對大腸桿菌細胞具有毒性，抑制了細胞的生長。因此，最適的IPTG濃度為0.6 mmol/L。

圖1 IPTG濃度對重組大腸桿菌產L-乳酸的影響Fig.1 Effect of IPTG concentration on L-lactic acid production by recombinantE.coli

2.1.2 培養基初始pH值對分泌表達蘋乳酶的影響

考察培養基初始pH值對重組菌分泌表達蘋乳酶的影響，結果如圖2所示。由圖2可知，初始pH值在5.0～7.0范圍內，隨著初始pH值增加，L-乳酸的產量呈現先增加后減少的趨勢。當初始pH值為5.0～6.0時，L-乳酸的產量隨初始pH值增加而增加；當初始pH值達到6.0時，L-乳酸的產量最大；當初始pH值＞6.0時，L-乳酸的產量隨初始pH值增加而減少，可能是培養基初始pH值過低或過高都不利于重組大腸桿菌產生蘋乳酶。因此，最適的培養基初始pH為6.0。

圖2 培養基初始pH值對重組大腸桿菌產L-乳酸的影響Fig.2 Effect of initial pH of medium on L-lactic acid production by recombinantE.coli

2.1.3 誘導時間對分泌表達蘋乳酸酶的影響

考察誘導時間對重組菌分泌表達蘋乳酸酶的影響，結果如圖3所示。由圖3可知，當誘導時間在0～4 h時，L-乳酸的產量隨誘導時間延長逐漸增加；當誘導時間為4 h時，發酵上清液中L-乳酸的產量達到最大；當誘導時間＞4h后，L-乳酸的產量反而降低?？赡苁且驗檎T導時間4 h后，菌體生物量達到最大，菌體生長進入穩定期，隨誘導時間的增加，菌體生長緩慢，則蘋乳酶的產量逐漸降低，L-乳酸產量減少；還有可能是IPTG雖然可以直接進入菌體內部發揮誘導作用，并穩定誘導目的蛋白，但其不能被菌體所利用，長時間存在菌體內，對大腸桿菌有毒害作用，從而導致隨誘導時間延長，L-乳酸的生成量降低的現象。因此，最適的誘導時間為4 h。

圖3 誘導時間對重組大腸桿菌產L-乳酸的影響Fig.3 Effect of IPTG inducing time on L-lactic acid production by recombinantE.coli

2.1.4 誘導溫度對分泌表達蘋乳酸酶的影響

考察誘導溫度對重組大腸桿菌產蘋乳酸酶的影響，結果如圖4所示。由圖4可知，當誘導溫度在25～28℃范圍內，L-乳酸的產量隨誘導溫度的增加呈上升趨勢；當誘導溫度為28℃時，發酵L-乳酸的產量達到最高；而當誘導溫度高于28℃之后，L-乳酸的產量則不斷減少。分析原因可能是因為在誘導表達的過程中，大腸桿菌生長過速會加重細菌合成系統的負擔，導致包涵體的形成，從而降低目的酶的產量，即L-乳酸量降低；而在低溫條件下，可減少菌體內一些不必要的代謝反應，可使多肽鏈有充裕的時間和空間進行正確折疊，成為有活性的蛋白，同時較低溫度時，大腸桿菌生長代謝緩慢，比較不容易形成包涵體[25]。因此，最適的誘導溫度為28℃。

圖4 誘導溫度對重組菌大腸桿菌產L-乳酸的影響Fig.4 Effect of inducing temperature on L-lactic acid production by recombinantE.coli

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對誘導時間（A）、誘導溫度（B）、初始pH值（C）和IPTG濃度（D）4個因素各設3個水平進行分析，以L-乳酸含量為評價指標，正交試驗結果與分析見表2。

表2 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

由表2可知，對重組菌產L-乳酸能力的影響順序由小到大排序為B（誘導溫度）＞C（培養基pH）＞A（誘導時間）＞D（IPTG濃度）。由表可以得出理論最佳組合是A1B2C2D2，即IPTG為0.6 mmol/L，培養基初始pH為5.9，28℃誘導3 h。在此優化條件下，L-乳酸的生成量為2.37 g/L。

3 結論

本研究通過單因素和正交試驗優化重組大腸桿菌分泌表達蘋乳酶發酵條件，最優發酵條件為IPTG濃度為0.6mmol/L、培養基初始pH值為5.9、誘導溫度28℃、誘導時間3 h，在最優條件下，L-乳酸產量達到2.37 g/L，較優化前產量提高9.48倍。

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