大腸桿菌質(zhì)粒DNA提取方法的研究

李 恒

(宿州市環(huán)境監(jiān)測(cè)站 安徽宿州 234000）

1 引言

目前常見(jiàn)的DNA的提取方法主要有煮沸法、堿裂解法等，并且通過(guò)去除蛋白質(zhì)和RNA以達(dá)到純化質(zhì)粒DNA的目的，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室的方法是堿裂解法。

2 方法

2.1 煮沸法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA

2.1.1 DNA提取方法

（1）在適當(dāng)?shù)暮股兀ū热纾郝让顾氐龋┑?0mL LB培養(yǎng)基中接種單一的大腸桿菌菌落，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期以250r/min培養(yǎng)12-16 h；（2）將10mL大腸桿菌培養(yǎng)液置入微量離心管中于4℃下以12000r/min離心9min，將未分離的菌液保存；（3）離心后的溶液棄去上清夜，倒置于吸水紙上，并用吸管除去培養(yǎng)液滴；（4）用 350μlSTET 重懸大腸桿菌沉淀；（5）加入 25μl新配制的溶菌酶溶液，蓋上離心管蓋，輕輕渦懸3s后，并置于沸水浴40s；（6）在室溫下用微量離心機(jī)以12000r/min離心15 min，將上清夜倒于滅菌潔凈試管中；（7）在上清液中加入40ul 2.5mol/L的乙酸鈉（pH5.2）和420ul異丙醇，以沉淀核酸，振蕩混勻溶液，并在室溫下放置5min，在4℃下以10000r/min離心10min,回收沉淀的核酸；（8）倒置于紙巾上使其液體流盡，并用吸管除去液滴，之后用1ml 70%的乙醇漂洗核酸沉淀，離心除去上清液，并除去所有的乙醇液滴，敞口放置在室溫下直到乙醇全部揮發(fā)，用50 μl含RNAseA的TE（pH8.0）溶解核酸，輕輕渦旋混勻。

2.1.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

上述的溶液與EB混合染色進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后在紫外分析儀下觀(guān)察，并且進(jìn)行拍照檢測(cè)。

2.2 堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA

2.2.1 DNA提取方法

（1）在適當(dāng)?shù)暮股氐?5mL LB培養(yǎng)基中接種單一的大腸桿菌菌落，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期以250r/min培養(yǎng)12-16 h；（2）取4.5mL大腸桿菌菌液以12000r/min離心 9min，棄去上清夜，盡量棄去干凈，可以用小的槍頭移去；（3）再加入100 μl冰預(yù)冷溶液Ⅰ，利用渦懸振蕩器振蕩，從而使菌體充分，室溫放置2min；（4）加入200μl新配置的溶液Ⅱ，輕輕將離心管上下顛倒5～7 次，混勻，室溫放置下 2min；（5）加入 150 μl冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，輕輕將離心管上下顛倒5～7次，直至白色的沉淀充分形成，冰上放置3分鐘，以12000r/min離心5min；（6）轉(zhuǎn)移上清，并加入兩倍體積的95%乙醇，室溫放置5min后，以12000r/min離心5min；棄去上清；用200μlTE溶解沉淀，加入150 μl 6mol/L NH4Ac(pH8.0)，充分混勻后冰上放置3分鐘，以12000r/min離心5min；（7）棄去上清，并加入兩倍體積的95%乙醇，室溫放置5min后，以12000r/min離心5min；（8）棄去上清，沉淀用70%的無(wú)水乙醇洗滌；（9）離心除去上清液，并除去所有的乙醇液滴，敞口放置在室溫下直到乙醇全部揮發(fā)，用50 μl含RNAseA的TE（pH8.0）溶解核酸，輕輕渦旋混勻。

2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

上述的溶液與EB混合染色進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后在紫外分析儀下觀(guān)察，并且進(jìn)行拍照，檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 煮沸法提取的大腸桿菌質(zhì)粒DNA電泳結(jié)果

此圖是煮沸法提取的大腸桿菌質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，這張圖沒(méi)有經(jīng)過(guò)RNA酶的處理，從圖中我們可以明顯看出電泳結(jié)果條帶太暗，也由此說(shuō)明質(zhì)粒DNA提取的濃度很低，煮沸法提取質(zhì)粒DNA效果并不是很好，因?yàn)樵谥蠓械倪^(guò)程中限制酶并不會(huì)完全消失，質(zhì)粒DNA會(huì)降解。

3.2 堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA

此圖是堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，這張圖未經(jīng)過(guò)RNA酶的處理，這張圖我們可以明顯的看到電泳結(jié)果條帶比較亮，條帶也很清晰，此法提取質(zhì)粒DNA的效果比較好。在裂解過(guò)程中，大腸桿菌的蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體會(huì)纏繞成比較大的復(fù)合物，此后被十二烷基硫酸鹽包蓋，鉀離子取代鈉離子復(fù)合物沉淀，能夠?qū)崿F(xiàn)很好的分離。

圖3-1 煮沸法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3-2 堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

結(jié)語(yǔ)

通過(guò)以上煮沸法，堿裂解法兩種方法對(duì)大腸桿菌提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行跑電泳的結(jié)果看來(lái)堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA的亮帶最為清晰，而煮沸法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA的條帶最暗。

[1]皺湘輝，莊東紅，鐘名其等.大腸桿菌質(zhì)粒DNA不同提取方法的比較 [J].汕頭大學(xué)學(xué)報(bào)，2003.5,18(2):20-21.

[2]朱玉賢,李毅.現(xiàn)代分子生物學(xué).北京：高等教育出版社[M]，1997.