酶法合成對羥基苯甘氨酸工藝研究

賀瑩

摘 要：該文通過生物酶法合成中對酶反應的各項條件比色法的測定，結果表明，在溫度40℃、pH值8.5、底物濃度4%、酶濃度80mg/mL條件下，酶活力最高，金屬離子Co2+、Mn2+ 和Ni2+ 對酶活力有促進作用，從而使酶反應的轉化率和產品的收率達到最大化，進而可以運用于其工業化的生產。

關鍵詞：酶法合成；D-對羥基苯甘氨酸；茚三酮顯色法；酶活力

中圖分類號 TS213.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）03-04-0016-2

Abstract：Enzymatic is to obtain optical pure D-hydroxy phenyl glycine on important way. Based on the enzymatic synthesis of enzyme reaction in the conditions for the determination of colorimetric method，it is concluded that the enzyme reaction optimum temperature of 40 ℃，the optimum pH value of 8.5，the optimum substrate concentration was 4%，the optimal enzyme concentration was 80 mg/mL and metal ions can improve the enzyme reaction dynamic Co2+，Mn2+and Ni2+，etc. So that the enzyme reaction conversion and product yield to maximize，and can be applied to the industrialized production.

Key words：Enzymatic synthesis.；D - hydroxy phenyl glycine；Ninhydrin color；Enzymatic activity

D-對羥基苯甘氨酸，分子量為167.16，熔點為204℃，微溶于乙醇和水，易溶于酸或堿溶液生成鹽[1-2]。國內大部分的生產企業基本也都采用乙醛酸工藝生產[3-4]。而這2種方法都為D-對羥基苯甘氨酸的化學生產法，這類方法不僅污染較大，生產過程中會產生氰化物，毒性高，而且原料昂貴、產量低、反應時間長，還會產生大量的廢棄物，因而學者們開始研究用酶法生產D-對羥基苯甘氨酸[4-6]。

生物酶法生產又可分為2種，分別為酶拆分法和酶轉化法，本實驗主要研究酶轉化法。酶轉化法是指以DL-對羥基苯海因為底物，利用海因酶先將底物水解為N-氨甲酰基-D-對羥基苯甘氨酸，然后再用D-N-氨甲酰基氨基酸水解酶脫去氨甲酰基得到D-對羥基苯甘氨酸[7]的過程。

1 材料與方法

1.1 試劑 D-海因酶，N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶為上海源葉生物科技有限公司，DL-對羥基苯海因，氫氧化鈉，鹽酸，水合茚三酮，正丁醇為天津市天力化學試劑有限公司生產。

1.2 儀器與設備 高壓滅菌鍋：江陰濱江，pH計：上海雷磁，紫外可見分光光度計：北分瑞利。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的制備 見參考文獻[8-9]。

1.3.2 底物濃度對酶反應的影響 制備好4種不同濃度梯度的DL-對羥基苯海因溶液，分別為2%、4%、6%和8%，然后滴加NaOH溶液與HCl溶液，濃度都為6mol/L，使初始pH值調為9；在制備好的底物溶液中加入與底物相同質量的酶溶液，再在錐形瓶中通入氮氣以置換出氧氣，并用保鮮膜進行密封；然后在水浴恒溫振蕩器中振蕩反應48h，溫度為33℃，得到反應液，待測[10]。

1.3.3 pH對酶反應的影響 稱取0.38g的DL-對羥基苯海因粉末，溶解于90mL1/15M的磷酸鹽緩沖液中（取5種不同的pH值，分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0），并加熱進行溶解；溶解后取9mL溶液裝于錐形瓶中，同時加入相同濃度的1.0mL酶溶液，再在錐形瓶中通入氮氣以置換出氧氣，并用保鮮膜進行密封；然后在水浴恒溫振蕩器中振蕩反應30min，溫度為33℃，后再加入濃度為6mol/L的HCl終止反應，得到反應液，待測。

1.3.4 溫度對酶反應的影響 按照測酶活力的方法，在4種不同溫度條件下測定其酶活力，分別為30℃、33℃、35℃和40℃，在水浴恒溫振蕩器中振蕩反應30min；后再加入濃度為6mol/L 的HCl溶液終止反應，得到反應液，待測。

1.3.5 酶濃度對酶反應的影響 配制3種濃度分別為40mg/mL、60mg/mL和80mg/mL的酶溶液備用；然后制備底物濃度為4mg/mL的DL-對羥基苯海因溶液，并滴加NaOH溶液與HCl溶液，濃度都為6mol/L，使初始pH 值調為9；再取3個錐形瓶，每個錐形瓶中分別裝入10mL溶液，同時在其中加入相同體積已配好的酶溶液，并在錐形瓶中通入氮氣以置換出氧氣，用保鮮膜進行密封；最后在水浴恒溫振蕩器中振蕩反應，按24h，36h，48h等不同時間段，溫度為33℃，并得到反應液，待測。

1.3.6 金屬離子對酶反應的影響 制備濃度為4mg/mL的DL-對羥基苯海因溶液，并滴加NaOH溶液與HCl溶液，濃度都為6mol/L，使初始pH值調為9；再取5個錐形瓶，每個錐形瓶中分別裝入10mL溶液，同時在其中加入相同質量的酶溶液，再在其中分別滴加含Co2+、Mn2+、Ni2+、Hg2+和Cu2+的溶液，并在錐形瓶中通入氮氣以置換出氧氣，用保鮮膜進行密封；最后在水浴恒溫振蕩器中振蕩反應48h，溫度為33℃，得到反應液，待測。

2 結果與分析

2.1 底物濃度對產物濃度的影響 從表1分析可得，酶濃度越大，生成相似濃度的產物所用時間越少，即加大酶濃度，酶反應速率加快。

2.2 pH值對酶活力的影響 從表2中分析可得，當pH值為8.5時，酶反應的活力最高。

2.3 溫度對酶活力的影響 從表3中分析可得，當溫度為40℃時，酶反應的活力最高。

2.4 金屬離子對酶活力的影響 從表4可知，當pH值和溫度都適宜時，酶反應的活力大約0.320～0.340，所以通過比較可得知，Co2+、Mn2+和Ni2+對酶反應的活力有加強作用，而Hg2+和Cu2+對酶反應的活力有抑制作用。

3 結論

采用茚三酮顯色法對不同酶反應條件下生成的D-對羥基苯甘氨酸進行測定，并通過酶活力公式的計算，得出了該酶反應的最適底物濃度為4%、最適pH值為8.5、最適溫度為40℃以及可以起酶活力加強作用的金屬離子為Co2+、Mn2+和Ni2+。

參考文獻

[1]董妍玲，譚新國，潘學武，等.海因酶法制備D-對羥基苯甘氨酸的研究進展[J].氨基酸和生物資源，2009，31（3）：47-52.

[2]陳建波，徐毅.生物酶法制備D-對羥基苯甘氨酸的研究[J].生物學雜志，2007，24（5）：35-47.

[3]趙欣.雙酶法合成D-HPG轉化條件的研究及高產菌株的選育[D].沈陽：沈陽藥科大學，2006.

[4]宋慧敏，屠春燕，歐陽平凱，等.高效液相色譜法測定D-對羥基苯甘氨酸[J].南京工業大學學報，2002，24（4）：17-20.

[5]馬飛，許激揚，何林松，等.雙酶法合成D-（-）-對羥基苯甘氨酸[J].中國藥科大學學報，2001，32（2）：155-158.

[6]駢巖杰，趙繼全，PianYanjie，等.D-對羥基苯甘氨酸合成的研究進展[J].精細石油化工，2010，27（3）：11-15.

[7]王燕妮.D-對羥基苯甘氨酸生物合成研究進展[J].雞西大學學報，2011，11（11）：78-81.

[8]許激揚，馬飛，李雋，等.雙酶法合成中D-對羥基苯甘氨酸及其中間體的測定[J].藥物生物技術，2003，10（4）：248-250.

[9]姜岷，姚忠，屠春燕，等.Burkholderia cepecia JS-02 酶法制備對羥基-D-苯甘氨酸的研究[J].江蘇大學學報（自然科學版），2003，24（5）：90-93.

[10]齊延紅，丁玉華，連惠勇，等.D-對羥基苯甘氨酸的酶法生產工藝研究[J].中國醫藥工業雜志，2001，32（3）：110-114.

（責編：張宏民）