耐鹽米曲霉育種及其在廣式醬油釀造中的應(yīng)用

梁亮 滑歡歡 符姜燕 鄭二帥

摘 要：通過對耐鹽米曲霉育種及其在廣式醬油釀造中應(yīng)用的研究，結(jié)果表明，滬釀3.042米曲霉菌株經(jīng)復(fù)合誘變，中性蛋白酶活力基本穩(wěn)定在7569U/g，約是出發(fā)菌株的1.9倍。突變菌株HN01傳代15次，均未檢出黃曲霉毒素，食品安全性能穩(wěn)定。在制曲過程中，添加食鹽誘導(dǎo)，提高了突變菌株的中性蛋白酶的耐鹽性，經(jīng)HN01菌種釀造出的天然油氨基酸態(tài)氮較對照樣提高了8.6%。

關(guān)鍵詞：廣式醬油；釀造；耐鹽米曲霉

中圖分類號 TS264.21 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）11-0011-03

Abstract：Through the research on salt-tolerant Aspergillus oryzae breeding and its application in Cantonese-style soy sauce brewing， the complex mutation of Aspergillus oryzae 3.042 strain showed that the neutral protease activity was basically stable at 7569 U/g， about 1.9 times that of the original strain. The mutant strain HN01 was passaged 15 times and no aflatoxin was detected. The food safety performance was stable. In the process of koji-making， addition of salt induces the salt-tolerance of the neutral protease of the mutant strain to be improved. Therefore， the amino acid nitrogen of the natural oil brewed by the HN01 strain is increased by 8.6% compared with the control sample.

Key words：Cantonese-style soy sauce；Brewing；Salt-tolerant Aspregillus oryzae

1 引言

對于高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵工藝，其生產(chǎn)過程可分為大曲階段和醬醪階段2個(gè)階段。大曲階段是米曲霉合成和分泌蛋白酶的時(shí)期，是決定醬油氨基態(tài)氮生成的前提。醬醪階段是蛋白酶水解大豆蛋白生成氨基態(tài)氮的主要時(shí)期，是決定醬油品質(zhì)的關(guān)鍵。溫度和水分是大曲階段的主要工藝參數(shù)，會(huì)顯著影響米曲霉的生長和產(chǎn)酶。溫度和鹽度是醬醪階段的最主要的工藝參數(shù)，不僅會(huì)影響蛋白酶的活性，還會(huì)影響其穩(wěn)定性。研究米曲霉固態(tài)發(fā)酵過程中溫度和水分對菌體的生長及酶合成的規(guī)律，可以提高大曲階段蛋白酶的產(chǎn)量。研究蛋白酶在高鹽環(huán)境下的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和失活動(dòng)力學(xué)，可以為醬醪發(fā)酵工藝的優(yōu)化及耐高鹽蛋白酶添加策略提供理論依據(jù)，進(jìn)一步提高醬油品質(zhì)并縮短發(fā)酵周期。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)主要材料 釀造醬油生產(chǎn)原料：黃豆、面粉、麩皮，從市場采購。滬釀3.042米曲霉菌種：由上海市釀造科學(xué)研究所提供。亞硝基胍、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈣試劑：由廣州化學(xué)試劑廠提供。

2.2 主要設(shè)備 超凈工作臺、NK式蒸煮鍋、發(fā)酵池、培養(yǎng)箱、3m3發(fā)酵罐。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 亞硝基胍與紫外線復(fù)合誘變及菌株初篩 （1）單孢子懸液制備：取28℃培養(yǎng)3d的斜面菌種，用50mL無菌水洗下孢子，置于三角瓶28℃、300r/min振蕩30min，使孢子分散，用滴管加半滴吐溫80，調(diào)整密度至106個(gè)/mL。（2）亞硝基胍誘變：吸取1mL單孢子懸液加入1mL 0.4mg/mL亞硝基胍溶液，使其終質(zhì)量濃度為0.2mg/mL。28℃振蕩反應(yīng)30min。誘變結(jié)束后加入10mL、pH8.0磷酸緩沖液，4500r/min離心10min終止反應(yīng)。（3）紫外線誘變：將上一步誘變完畢的孢子在紫外燈下30cm處照射處理20min。誘變結(jié)束后加入10mL、pH8.0磷酸緩沖液，4500r/min離心10min終止反應(yīng)。（4）初篩：適當(dāng)稀釋誘變液，取適當(dāng)稀釋液涂布于耐鹽性中性蛋白酶初篩培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)72h后計(jì)算致死率，并用透明圈法篩選蛋白酶酶解圈增大最大的菌株。耐鹽性中性蛋白酶初篩培養(yǎng)基配方：脫脂奶粉4g、磷酸二氫鉀0.36g、磷酸氫二鈉1.07g、氯化鋅0.04g、氯化鈣0.002g、硫酸鎂0.5g、硫酸亞鐵0.02g、氯化鈉100g、胰蛋白胨0.04g、瓊脂10g、蒸餾水1000mL，121℃滅菌15min。

2.3.2 誘變菌種復(fù)篩、傳代及遺傳穩(wěn)定性、食品安全性研究 （1）復(fù)篩：將初篩所得K值較大的8株菌落轉(zhuǎn)接至斜面并培養(yǎng)成熟后，各轉(zhuǎn)接1個(gè)三角瓶，于32℃條件下培養(yǎng)72h后檢測中性蛋白酶活力。復(fù)篩培養(yǎng)基配方：豆粕500g、麩皮500g、自來水800mL，拌勻后裝量為100g濕料/L三角瓶。（2）遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)：將經(jīng)過多次復(fù)篩后得到的菌株連續(xù)傳代15次，每次傳代后篩選出生長較好的菌株接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后測定其中性蛋白酶活力。（3）食品安全性測定：將突變株的三角瓶發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行黃曲霉毒素總量檢測。

2.3.3 食鹽誘導(dǎo)制曲工藝的研究 （1）食鹽對成曲酶活力的影響：根據(jù)已優(yōu)化的制曲工藝，在混合料中分別添加0%、0.5%、1%、1.5%、2%的食鹽，檢測成曲中性蛋白酶活力。（2）無機(jī)鹽對成曲酶活力的影響：根據(jù)已優(yōu)化的制曲工藝，在混合料中分別添加K2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4、Na2HPO4、CaCl2、FeSO4、MnSO4，其中FeSO4、MnSO4的添加量為0.02%，其余6種為0.2%，其他條件不變，檢測中性蛋白酶酶活力。

2.3.4 新菌株在醬油釀造中的應(yīng)用 按照廣式天然油釀造工藝驗(yàn)證突變株和出發(fā)菌株對天然油氨基酸態(tài)氮的影響，具體工藝參數(shù)見表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 亞硝基胍與紫外線復(fù)合誘變及菌株初篩

3.1.1 誘變致死率 計(jì)算公式如下：

致死率（%）=（未經(jīng)處理組菌落總數(shù)-處理后菌落總數(shù)致死率）/未經(jīng)處理組菌落總數(shù)×100

由表2可知，經(jīng)歷亞硝基胍與紫外線復(fù)合誘變后，出發(fā)菌種致死率為89.1%。

3.1.2 菌種初篩結(jié)果 在初篩培養(yǎng)基上分別測量菌株的透明圈直徑和菌落直徑，根據(jù)K值（K值為透明圈直徑/菌落直徑）篩選出8株K值較大菌株，如表3所示。由表3可知，初篩出的誘變菌種的K值均高于原始菌株滬釀3.042的K值，故下一步將對這8株菌株進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩，測定中性蛋白酶酶活力。

3.2 誘變菌種復(fù)篩、傳代及遺傳穩(wěn)定性、食品安全性研究

3.2.1 發(fā)酵復(fù)篩結(jié)果 透明圈直徑與菌落直徑相比可以作為產(chǎn)酶能力大小的指標(biāo)。將初篩所得K值較大的8株菌落轉(zhuǎn)接至斜面并培養(yǎng)成熟后，各轉(zhuǎn)接1個(gè)三角瓶，于32℃條件下培養(yǎng)72h后檢測中性蛋白酶活力，結(jié)果見圖1。從圖1中可以得出，1株高產(chǎn)蛋白酶活力的菌株米曲霉HN01，其蛋白酶活力為7569U/g，約是出發(fā)菌株的1.9倍。

3.2.2 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn) 將最終篩選的米曲霉HN01菌株連續(xù)傳代15次，分別測定其中性蛋白酶活力，結(jié)果如表4所示。從表4中可以得出，其中性蛋白酶活力一直穩(wěn)定在以上，表明該變異菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。從表4中可以得出，其中性蛋白酶活力一直穩(wěn)定在7500U/g以上，表明該變異菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3.2.3 食品安全遺傳穩(wěn)定性 將突變株在表4中的三角瓶發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行黃曲霉毒素總量的檢測，所傳的15代均為未檢出黃曲霉毒素。

3.3 食鹽誘導(dǎo)制曲工藝的研究

3.3.1 食鹽對成曲酶活力的影響 由圖2可知，隨著食鹽添加量的增加，耐鹽性中性蛋白酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，食鹽添加量小于1%時(shí)，對酶系產(chǎn)生的抑制較小，可有效誘導(dǎo)并提升耐鹽性蛋白酶活力。超過此添加量時(shí)，食鹽對酶系的抑制作用增大，不利與后期發(fā)酵中氨基酸態(tài)氮的生成。綜上所述，食鹽的最適添加量為1%，此時(shí)耐鹽性中性蛋白酶活力可達(dá)2738U/g。

3.3.2 無機(jī)鹽對成曲酶活力的影響 在混合料中分別添加K2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4、Na2HPO4、CaCl2、FeSO4、MnSO4，其中FeSO4、MnSO4的添加量為0.02%，其余6種為0.2%，其它條件不變，檢測中性蛋白酶酶活力，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，Ca2+對產(chǎn)酶有一定的抑制作用，這是因?yàn)橹行缘鞍酌甘且环N金屬酶，它的輔酶是Zn2+，在培養(yǎng)基中添加Ca2+會(huì)使它取代一部分活性部位的Zn2+，從而使中性蛋白酶酶活力降低。而KH2PO4和Na2HPO4能使酶活力明顯升高。它們2種都是磷酸鹽，對微生物的生長非常重要。添加濃度為0.2%的KH2PO4和Na2HPO4會(huì)對產(chǎn)酶有一定作用，其他的無機(jī)鹽對米曲霉產(chǎn)酶并沒有太大影響。所以我們選擇KH2PO4和Na2HPO4作為添加的無機(jī)鹽。

3.4 突變株HN01在醬油釀造中的應(yīng)用 按照廣式天然油釀造工藝，對比不同菌種對天然油理化指標(biāo)的影響。由表5可知，米曲霉滬釀3.042經(jīng)誘變后，提高中性酶活力，食鹽誘導(dǎo)制曲工藝，增強(qiáng)了米曲霉分泌中性蛋白酶的耐鹽性，因此經(jīng)HN01菌種發(fā)酵出的天然油氨基酸與對照樣相比提高了8.6%。

4 結(jié)論

滬釀3.042米曲霉菌株經(jīng)復(fù)合誘變，中性蛋白酶活力基本穩(wěn)定在7569U/g左右，約是出發(fā)菌株的1.9倍。突變菌株HN01傳代15次，均未檢出黃曲霉毒素，食品安全性能穩(wěn)定。在制曲過程中，添加食鹽誘導(dǎo)，提高了突變菌株的中性蛋白酶的耐鹽性，經(jīng)突變株HN01菌種發(fā)酵出的天然油氨基酸較對照樣提高了8.6%。

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（責(zé)編：張宏民）