基于光譜法的脾虛脹滿合劑指紋圖譜研究

張文文，伍文彬，楊　慧，曾琦璐，鐘林江，張文靜

(1.成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都　610052；2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，四川 成都　610075；3.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都　610106)

0　引　言

隨著中藥與中藥制劑的廣泛應(yīng)用，其質(zhì)量控制一直都是中藥研究與生產(chǎn)中的難點(diǎn)與熱點(diǎn)，也是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)的關(guān)鍵[1].由于中藥含有的化學(xué)種類成分較多且復(fù)雜，測(cè)定其中少數(shù)幾種成分指標(biāo)難以完全定性，所以中藥的質(zhì)量控制比合成的化學(xué)藥品難度要大很多.同時(shí)，因中藥中這些成分通常在治療方面具有協(xié)同作用，故應(yīng)從化學(xué)成分整體角度評(píng)價(jià)其質(zhì)量[2-4].中藥指紋圖譜是基于對(duì)中藥物質(zhì)整體作用的認(rèn)識(shí)，借助于波譜和色譜等技術(shù)手段獲得中藥化學(xué)成分的光譜或色譜圖，可以較充分地反映出中藥復(fù)雜混合體系中各種化學(xué)成分量分布的整體狀況，并將一些未明確的有效成分表征在圖譜中，這對(duì)藥物質(zhì)量的控制和評(píng)價(jià)具有重要意義[5-8].中藥指紋圖譜包括紅外光譜法、紫外光譜法、核磁共振波譜法、電化學(xué)法、薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法等[9].其中，紫外—可見(jiàn)指紋圖譜法能反映樣品在200～900 nm波長(zhǎng)下的吸收情況，具有簡(jiǎn)便快速、綜合信息量大的特點(diǎn)；紅外指紋圖譜是混合物中各組分紅外光譜的疊加，對(duì)中藥的定性鑒別有良好的專一性，并且具有快捷、簡(jiǎn)單以及測(cè)試成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[10-11].

脾虛脹滿合劑是由枳殼、生白術(shù)、干姜、檳榔、紫蘇葉與炙甘草等多味中藥組成的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有健脾行氣、消痞除滿之功效，常用于脾虛氣滯證見(jiàn)腹脹腹?jié)M、不欲飲食、大便不暢、苔白膩與脈沉細(xì)者[12].本課題在前期研究中，已建立了脾虛脹滿合劑的初步質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括枳殼、干姜、炙甘草的薄層鑒別項(xiàng)，以及柚皮苷、新橙皮苷、甘草苷和甘草酸的含量測(cè)定項(xiàng).因脾虛脹滿合劑由6味中藥組成，化學(xué)成分眾多，故其指標(biāo)性成分不能代表其真實(shí)的發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，測(cè)定少數(shù)指標(biāo)成分不足以說(shuō)明合劑的質(zhì)量.對(duì)此，本研究采用紫外指紋圖譜和紅外指紋圖譜這2種中藥指紋圖譜分析方法，并增加了對(duì)脾虛脹滿合劑在可見(jiàn)波長(zhǎng)下吸收情況的分析，建立脾虛脹滿合劑的紫外—可見(jiàn)指紋圖譜和紅外指紋圖譜2種評(píng)價(jià)方法，以從整體上控制和評(píng)價(jià)本品的質(zhì)量.

1　材料與儀器

1.1　材　料

實(shí)驗(yàn)所用的材料包括：溴化鉀(光譜純，批號(hào)，2017042101)，由成都科隆化學(xué)品有限公司生產(chǎn)；水為純凈水；脾虛脹滿合劑10批，自制.本研究前期對(duì)脾虛脹滿合劑的柚皮苷、新橙皮苷、甘草苷及甘草酸含量進(jìn)行了測(cè)定，并規(guī)定了限度.其中5批樣品符合規(guī)定，5批樣品不符合規(guī)定(見(jiàn)表1).

表1　10批脾虛脹滿合劑樣品含量測(cè)定結(jié)果

注：“√"符合規(guī)定的限度；“×"不符合規(guī)定的限度.

1.2　儀　器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：Tu-1810型紫外—可見(jiàn)分光光度儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；Spectrum Two型紅外光譜儀(Pekin Elmer公司)；BS-6KH型電子天平(上海有聲衡器有限公司)；FW-5型壓片機(jī)(天津博天勝達(dá)科技發(fā)展有限公司)；LD510-2R型電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司).

2　方法與結(jié)果

2.1　紫外—可見(jiàn)指紋圖譜

2.1.1測(cè)試條件.

實(shí)驗(yàn)中，以水調(diào)整基線并作為參比液進(jìn)行紫外光譜測(cè)定，使用UVWin紫外軟件V6.0.0采集光譜，設(shè)定掃描波長(zhǎng)為200～900 nm，光譜帶寬為2 nm，采樣間隔為1 nm，快速掃描，自動(dòng)切換波長(zhǎng)為361 nm.

2.1.2供試品制備方法.

1)精密吸取脾虛脹滿合劑(批號(hào)，20170215)1 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，制得供試品溶液a.

2)精密吸取脾虛脹滿合劑(批號(hào)，20170215)0.5 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，制得供試品溶液b.

3)精密吸取脾虛脹滿合劑(批號(hào)，20170215)2 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，吸取1 mL于100 ml容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，制得供試品溶液c.

4)精密吸取脾虛脹滿合劑(批號(hào)，20170215)1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，吸取0.4 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，制得供試品溶液d.

5)精密吸取脾虛脹滿合劑(批號(hào)，20170215)0.1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，吸取2 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，制得供試品溶液e.

按“2.1.1"項(xiàng)下的測(cè)試條件對(duì)供試品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1.其中，供試品溶液d的紫外—可見(jiàn)圖譜的吸光度大小適宜，峰谷明顯.故供試品的制備方法確定為：取脾虛脹滿合劑1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，吸取0.4 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻(即將脾虛脹滿合劑用水稀釋2 500倍)，即得.

圖1脾虛脹滿合劑稀釋2 500倍的紫外—可見(jiàn)圖譜

2.1.3精密度實(shí)驗(yàn).

取脾虛脹滿合劑(批號(hào)，20170215)，按“2.1.2"項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1.1"項(xiàng)下的測(cè)試條件連續(xù)測(cè)定6次.計(jì)算所得紫外—可見(jiàn)圖譜在波長(zhǎng)200 nm、223 nm、252 nm、282 nm、308 nm處吸光度的RSD%分別為0.35%、0.07%、0.29%、0.14%、0.45%.結(jié)果表明，儀器精密度良好.

2.1.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn).

取脾虛脹滿合劑(批號(hào)，20170215)，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1.1"項(xiàng)下的測(cè)試條件，每隔1h測(cè)定1次.5 h內(nèi)計(jì)算所得紫外—可見(jiàn)圖譜在波長(zhǎng)200 nm、223 nm、252 nm、282 nm、308 nm處吸光度的RSD%分別為0.57%、0.16%、0.94%、0.48%、1.54%.結(jié)果表明，樣品在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.1.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn).

取脾虛脹滿合劑(批號(hào)，20170215)，按“2.1.2"項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，平行6份，并按“2.1.1"項(xiàng)下的測(cè)試條件，分別測(cè)定.計(jì)算所得紫外—可見(jiàn)圖譜在波長(zhǎng)200 nm、223 nm、252 nm、282 nm、308 nm處吸光度的RSD%分別為1.62%、0.97%、1.42%、0.98%、1.51%.結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好.

2.1.6脾虛脹滿合劑紫外—可見(jiàn)光譜采集.

取10批脾虛脹滿合劑樣品，按“2.1.2"項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1.1"項(xiàng)下的測(cè)試條件分別進(jìn)行測(cè)定.10批脾虛脹滿合劑樣品的紫外—可見(jiàn)光譜疊加圖如圖2所示.

圖210批脾虛脹滿合劑樣品的紫外光譜疊加圖

2.1.7對(duì)照紫外—可見(jiàn)指紋圖譜的建立.

選擇在前期研究中含量測(cè)定符合規(guī)定的4批樣品(批號(hào)，20170215、20170220、20170227、20170305)，以其吸收強(qiáng)度的平均值為對(duì)照指紋圖譜的吸收強(qiáng)度，得到對(duì)照紫外—可見(jiàn)指紋圖譜如圖3所示.

圖3脾虛脹滿合劑的對(duì)照紫外—可見(jiàn)指紋圖譜

2.2　紅外指紋圖譜

2.2.1樣品制備.

用平頭微量進(jìn)樣針取10 μL脾虛脹滿合劑于瑪瑙研缽中，揮干，加入100 mg溴化鉀，沿同一方向研磨均勻，取適量研細(xì)后的粉末平鋪于紅外壓片模具中，以15 MPa壓力壓制2 min，將制備好的樣片置于紅外光譜儀中測(cè)定紅外光譜.

2.2.2精密度考察.

取脾虛脹滿合劑(批號(hào)，20170220)，按照“2.2.1”項(xiàng)下的方法壓片，并連續(xù)測(cè)定6次.計(jì)算所得紅外圖譜中各特征峰的波數(shù)的RSD%分別為，0.0042%、0.0057%、0.0003%、0.0037%、0.0061%、0.0026%、0.0039%、0.1304%.結(jié)果表明，儀器精密度良好.

2.2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn).

取脾虛脹滿合劑(批號(hào)，20170220)，按照“2.2.1”項(xiàng)下的方法壓片，置于干燥器中保存，分別在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h時(shí)測(cè)定.計(jì)算所得紅外圖譜中各特征峰的波數(shù)的RSD%分別為，0.0036%、0.0780%、0.0016%、0.0126%、0.0077%、0.0034%、0.0067%、0.0817%.結(jié)果表明，樣品在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.2.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn).

取脾虛脹滿合劑(批號(hào)，20170220)，按照“2.2.1”項(xiàng)下的方法，平行壓制6片，測(cè)定，計(jì)算所得紅外圖譜中各特征峰的波數(shù)的RSD%分別為，0.0272%、0.0725%、0.0040%、0.01767%、0.0135%、0.0651%、0.0367%、0.1815%.結(jié)果表明，本方法的重復(fù)性良好.

2.2.5脾虛脹滿合劑紅外光譜采集.

取10批脾虛脹滿合劑樣品，按“2.2.1"項(xiàng)下的方法壓片并分別測(cè)定，10批脾虛脹滿合劑樣品的紅外光譜疊加圖見(jiàn)圖4.

圖410批脾虛脹滿合劑樣品的紅外光譜疊加圖

2.2.6對(duì)照紅外指紋圖譜的建立.

選擇在前期研究中含量測(cè)定符合規(guī)定的4批樣品(批號(hào)為，20170215、20170220、20170227、20170305)，以其透光率的平均值為對(duì)照指紋圖譜的透光率，得到對(duì)照紅外指紋圖譜如圖5所示.

圖5脾虛脹滿合劑對(duì)照紅外指紋圖譜

2.3　限度要求

10批脾虛脹滿合劑的紫外—可見(jiàn)指紋圖譜在波長(zhǎng)200 nm、223 nm、252 nm、282 nm、308 nm處的吸光度值如表2所示.

將脾虛脹滿合劑樣品的紫外—可見(jiàn)指紋圖譜、紅外指紋圖譜分別與得到的對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度分析[13-14]，經(jīng)數(shù)據(jù)處理軟件“IBM SPSS statistics"中雙變量相關(guān)“Kendall的tau-b"分析計(jì)算相似度.綜合用于建立對(duì)照紫外—可見(jiàn)指紋圖譜的4批脾虛脹滿合劑在特征波長(zhǎng)下的吸光度值、脾虛脹滿合劑樣品的紫外—可見(jiàn)指紋圖譜、紅外指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度.脾虛脹滿合劑紫外—可見(jiàn)指紋圖譜的吸光度值應(yīng)分別滿足200 nm(0.954～1.371 Abs)、223 nm(0.477～0.687 Abs)、252 nm(0.122～0.174 Abs)、282 nm(0.248～0.361 Abs)、308 nm(0.104～0.149 Abs)，紫外—可見(jiàn)指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度應(yīng)不小于0.925，紅外指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度應(yīng)不小于0.861，結(jié)果如表3所示.

表2　10批脾虛脹滿合劑紫外—可見(jiàn)指紋圖譜吸光度值

表3　脾虛脹滿合劑指紋圖譜相似度分析結(jié)果

前期研究中，含量符合規(guī)定的脾虛脹滿合劑(批號(hào)：20170303)，其紫外—可見(jiàn)指紋圖譜在200 nm，223 nm，252 nm，282 nm，308 nm處的吸光度值滿足標(biāo)準(zhǔn)，紫外—可見(jiàn)指紋圖譜與紫外—可見(jiàn)對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.930，高于限度0.925，紅外指紋圖譜與對(duì)照紅外指紋圖譜的相似度為0.942，高于限度0.861.而含量不合格的5批樣品的吸光度或相似度均不滿足限度要求.

3　結(jié)　論

由于脾虛脹滿合劑中藥材較多，干擾較大，課題組尚未建立其他4味藥材定性定量控制方法，故采用紫外—可見(jiàn)圖譜與紅外圖譜的分析方法，并增加了對(duì)樣品在可見(jiàn)波長(zhǎng)下吸收情況的分析，建立脾虛脹滿合劑對(duì)照紫外—可見(jiàn)指紋圖譜和對(duì)照紅外指紋圖譜，從吸光度、樣品圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜相似度等方面對(duì)脾虛脹滿合劑的質(zhì)量進(jìn)行綜合分析.

本研究首次將紫外—可見(jiàn)指紋圖譜、紅外指紋圖譜應(yīng)用到脾虛脹滿合劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)中，確定了測(cè)試條件和供試品制備方法，并建立了脾虛脹滿合劑的對(duì)照紫外—可見(jiàn)指紋圖譜與對(duì)照紅外指紋圖譜，對(duì)脾虛脹滿合劑樣品進(jìn)行了吸光度與相似度的分析.結(jié)合脾虛脹滿合劑含量測(cè)定方法[12]與紫外—可見(jiàn)指紋圖譜與紅外指紋圖譜分析方法，在測(cè)定指標(biāo)性成分的同時(shí)，可從整體上控制脾虛脹滿合劑的質(zhì)量，從而提升脾虛脹滿合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).