腸道菌群模式菌株的HPLC分離條件優(yōu)化及其表征

邱丹騰, 張海玲, 陳玲琳, 潘超逸, 陳姍姍, 饒平凡, 劉樹滔

(1.福州大學(xué)生物工程研究所, 福建 福州　350002； 2.中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 浙江工商大學(xué)食品營養(yǎng)科學(xué)聯(lián)合研究中心, 浙江 杭州　310035)

0　引言

腸道菌群是目前生命科學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn), 與人體營養(yǎng)與健康有著密不可分的互惠共生關(guān)系.隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的成熟[1-4], 下一代測序技術(shù)的不斷進(jìn)展以及價(jià)格不斷下降[5-6], 大量宏基因組研究產(chǎn)生的海量測序數(shù)據(jù), 使不依賴于培養(yǎng)而進(jìn)行復(fù)雜且多樣的微生物群落研究成為可能.然而, 無論是現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)還是高通量測序技術(shù)各自在某些方面仍不甚完善, 有一些問題亟待解決[7-8].其中最關(guān)鍵的問題是, 這些方法都是對(duì)待測樣品中的DNA分子進(jìn)行分析, 所以具備理想的純度、 濃度和完整性樣品的總DNA的提取是研究的前提和關(guān)鍵.另外, 這兩大類分析技術(shù)都無法回收細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行生理生化分析, 從而進(jìn)一步確認(rèn)某種細(xì)菌的存在及其特性.如果能找到類似差異顯示PCR技術(shù)[9]的方法, 預(yù)先將腸道菌群樣品分成多個(gè)組分, 再分別提取DNA, 從而提高DNA的濃度和純度, 有望提高較低豐度細(xì)菌的DNA提取效率, 保證腸道微生物結(jié)構(gòu)多樣性及其豐度的檢測結(jié)果的完整性和準(zhǔn)確性.

高效液相色譜技術(shù)是微生物分離、 分析和制備方法的一種創(chuàng)新選擇.細(xì)菌作為帶電顆粒, 不同pH環(huán)境下其細(xì)胞表面帶有許多不同的電荷, 可以像生物大分子一樣, 利用離子交換色譜技術(shù)進(jìn)行分離[10-12].2006年, 陳章捷等[13]首次探討了運(yùn)用高效離子交換色譜分離、 分析動(dòng)物腸道菌群, 證明該方法能夠依據(jù)細(xì)菌的不同表面性質(zhì)分離腸道菌群, 但是該研究并未對(duì)其分離得到的色譜峰組分進(jìn)行鑒別.腸道中不同門類的細(xì)菌以及一些低豐度的細(xì)菌在HPLC中是否能夠被有效地檢測并分離； 各個(gè)洗脫峰組分分別代表哪些菌株, 這些問題都有待進(jìn)一步的探討.因此, 本研究選擇機(jī)體腸道環(huán)境中常見的和處于劣勢(shì)狀態(tài)的腸道細(xì)菌構(gòu)建腸道模式菌株, 模擬機(jī)體的腸道微生態(tài)系統(tǒng), 建立并優(yōu)化HPLC分離分析方法, 并對(duì)該方法進(jìn)行重現(xiàn)性和靈敏度試驗(yàn), 利用革蘭氏染色法對(duì)洗脫峰組分進(jìn)行鏡檢觀察.本研究建立的腸道菌群模式菌株HPLC分離分析方法, 將為后續(xù)糞便樣品中腸道菌群的研究奠定基礎(chǔ), 可望從腸道菌群混合體系中將細(xì)菌分離開來, 且該方法具有細(xì)菌細(xì)胞可回收的特點(diǎn).

1　材料與方法

1.1　儀器與材料

1.1.1菌株

青春雙歧桿菌(GImL278)、 鼠李糖乳桿菌(ATCC7469)、 脆弱擬桿菌(ATCC25285)、 產(chǎn)氣莢膜梭菌(ATCC13124)、 克雷伯肺炎桿菌(CMCC(B)40117)、 奇異變形桿菌(CMCC(B)49005)、 糞腸球菌(ATCC29212)購自廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司.大腸埃希菌(ATCC25922)、 金黃色葡萄球菌(ATCC6538)為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株.

1.1.2主要儀器和試劑

高效液相色譜儀(DL2000, 日本Hitachi公司)； 高速離心機(jī)(CF15RXII, 日本Hitachi公司)； 隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9080, 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)； pH計(jì)(FE20, 梅特勒-托利多(上海)有限公司)； 光學(xué)顯微鏡(BM1000, 南京江南永新光學(xué)儀器有限公司)； 5 L密封培養(yǎng)罐(C-31, 廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司).

哌嗪、 NaCl、 硫酸銨、 尿素、 NaOH等均為國產(chǎn)分析純藥品； 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、 血平板等購自廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司.

SuperQ-650C強(qiáng)陰離子交換樹脂(TSKgel SuperQ-TOYOPEARL 650C, 日本TOSOH公司).

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1腸道模式菌株樣品的制備

凍干菌粉以及甘油保種的菌株經(jīng)復(fù)蘇活化后, 按體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量轉(zhuǎn)接于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中, 分別對(duì)9種細(xì)菌進(jìn)行厭氧/需氧的增菌培養(yǎng).取培養(yǎng)好的菌液4 mL, 于4 ℃, 12 kr·min-1離心3 min, 盡量吸凈上清培養(yǎng)基, 沉淀下來的菌體用無菌水洗滌3遍, 最后將菌體充分懸浮于2 mL的無菌水中(相當(dāng)于濃縮了2倍), 即為各個(gè)單菌樣品, 每次上樣量為500 μL； 9種單菌樣品中各取220 μL制備成混合菌懸液, 充分振蕩均勻后, 即為腸道模式混合菌株樣品, 每次上樣量為500 μL.

1.2.2腸道模式菌株的HPLC分析

平衡緩沖液(A液)： 0.02 mol·L-1哌嗪-鹽酸緩沖液(pH=8.0)； 洗脫緩沖液(B液)： 0.02 mol·L-1哌嗪-鹽酸緩沖液(pH8.0)+1.0 mol·L-1NaCl.HPLC分析所需試劑均經(jīng)過0.22 μm的醋酸纖維膜過濾除菌后使用.

色譜系統(tǒng)： 采用日本Tosch公司的強(qiáng)陰離子交換樹脂TSKgel SuperQ-TOYOPEARL 650C色譜柱(200 mm×4.6 mm i.d.), 流速1 mL·min-1, 泵壓0.5～1.5 MPa, 溫度23～28 ℃.洗脫方法： 選擇四種不同的洗脫梯度, 對(duì)腸道模式混合菌株進(jìn)行色譜分離效果的比較, 確定最佳洗脫梯度.1)線性梯度洗脫： 細(xì)菌樣品進(jìn)樣后, 0～10 min用A液平衡, 使樣品中的細(xì)菌充分吸附到色譜柱上； 10～20 min用0～25% B液線性梯度洗脫； 20～40 min用25%～50% B液線性梯度洗脫； 40～80 min用50%～100% B液線性梯度洗脫； 80～100 min完全轉(zhuǎn)換為B液洗脫, 將殘留在樹脂上的細(xì)菌全部洗脫下來.2)階梯式梯度一： 洗脫時(shí)長共計(jì)110 min, A液平衡10 min, 10%～100% B液各洗脫10 min.3)階梯式梯度二： 洗脫時(shí)長共計(jì)140 min, 其中A液平衡10 min, 5%～70% B液各洗脫10 min.4)階梯式梯度三： 洗脫時(shí)長共計(jì)100 min, 其中A液平衡10 min, 10～60 min分別用10%、 15%、 20%、 25%、 30%的B液各洗脫10 min, 60～100 min用40%～70% B液各洗脫10 min.檢測條件： 采用HPLC紫外檢測池對(duì)通過色譜柱的細(xì)菌進(jìn)行在線檢測, 檢測波長260 nm.

1.2.3洗脫組分的鏡檢

腸道模式菌株及各個(gè)單菌色譜表征后, 采用滅菌的試管重復(fù)多次收集洗脫峰, 分別于4 ℃下12 kr·min-1離心3 min, 取少許沉淀涂片鏡檢, 采用革蘭氏染色法, 在油鏡(100×)下觀察.

1.2.4重復(fù)性試驗(yàn)

采用建立的階梯式梯度洗脫對(duì)腸道模式混合菌株及各個(gè)單菌進(jìn)行色譜表征, 重復(fù)試驗(yàn)5次, 分別計(jì)算各種細(xì)菌色譜表征的5次重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù).

1.2.5HPLC分離細(xì)菌的靈敏度及其吸附量分析

以鼠李糖乳桿菌作為考察HPLC靈敏度和檢出限的腸道模式代表菌株.1)濃縮菌液： 取培養(yǎng)至菌體濃度為OD600=0.576的菌液5 mL, 4 ℃下12 kr·min-1離心3 min, 沉淀下來的菌體用無菌水洗滌3遍, 最后充分懸浮于1 mL的無菌水中, 上樣量為500 μL； 2)標(biāo)準(zhǔn)菌液： 取培養(yǎng)至菌體濃度為OD600=0.576的菌液100 μL, 4 ℃下12 kr·min-1離心3 min, 用無菌水洗滌3遍, 得到的沉淀重懸于100 μL的無菌水中, 上樣量為20 μL.

2　結(jié)果與討論

2.1　色譜分離的洗脫條件優(yōu)化

參照生物分子色譜分離的方法, 嘗試優(yōu)化色譜分離的洗脫條件, 探討HPLC方法對(duì)腸道菌群模式混合菌株的分離純化, 以便為腸道菌群總DNA提取的改善等奠定基礎(chǔ).優(yōu)化首先從線性梯度開始摸索, 在此基礎(chǔ)上, 選定了在階梯式梯度洗脫溶液中所用的適宜濃度.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.

圖1　不同洗脫條件下腸道模式混合菌株的HPLC圖譜Fig.1　Chromatograms of the intestinal type mixed strains in different gradient elution conditions

中線性梯度洗脫如圖1(a)所示, 其分離效果差, 峰型過大且拖尾.因此嘗試用依次連續(xù)增加洗脫液中B液的百分含量(即NaCl的濃度)實(shí)現(xiàn)的階梯式梯度洗脫, 首先選定了含0.10 ～1.0 mol·L-1NaCl的洗脫液濃度, 結(jié)果如圖1(b)所示, 0.20、 0.30 mol·L-1處均出現(xiàn)兩個(gè)相連的洗脫峰.隨著洗脫液離子強(qiáng)度變化速率的減小, 如圖1(c)所示(從每10 min增加0.10 mol·L-1的變化速率減小為每10 min增加0.05 mol·L-1), 在0.15～0.30 mol·L-1之間實(shí)現(xiàn)了圖1(b)中相連洗脫峰的分離, 并且在0.35～0.45 mol·L-1洗脫區(qū)間未出現(xiàn)洗脫峰.在圖1(a)、 1(b)中, 0.70～1.0 mol·L-1洗脫區(qū)間均未出現(xiàn)洗脫峰, 說明各組分在0.10～0.70 mol·L-1的洗脫液的洗脫過程中已經(jīng)被全部洗脫下來.為縮短洗脫時(shí)間, 提高分離效率, 最終確定了分離腸道模式混合菌株的最佳洗脫條件： 階梯式梯度三, 結(jié)果如圖1(d)所示, 其分離效果好、 分辨率高.

2.2　單菌的色譜表征

為考察各個(gè)目的細(xì)菌在腸道模式混合菌的HPLC色譜圖中的出峰位置(洗脫液中NaCl的濃度), 在建立的最佳階梯式梯度洗脫條件的基礎(chǔ)上, 本研究探索了各單菌的色譜行為.各單菌上樣量為500 μL, 洗脫條件為階梯式洗脫梯度三, 結(jié)果如圖2所示.

圖2　不同細(xì)菌的HPLC圖譜Fig.2　Chromatograms of different bacteria

從圖2中可以看出, 脆弱擬桿菌的出峰位置為0.10 mol·L-1, 其余小峰鏡檢結(jié)果未觀察到菌體(見圖2(a))； 金黃色葡萄球菌出現(xiàn)了前后兩個(gè)色譜峰, 其中0.10 mol·L-1處的鏡檢結(jié)果為細(xì)菌峰, 0.50 mol·L-1處未觀察到菌體(見圖2(b))； 青春雙歧桿菌及鼠李糖乳桿菌的出峰位置均為0.20 mol·L-1(見圖2(c), (d))； 糞腸球菌的出峰位置為0.25 mol·L-1, 其余小峰鏡檢結(jié)果未觀察到菌體(見圖2(e))； 產(chǎn)氣莢膜梭菌出現(xiàn)了三個(gè)明顯的色譜峰(可能與其表面莢膜多糖含量有關(guān)), 分別在0.10、 0.30及0.50 mol·L-1處, 根據(jù)反復(fù)收集得到的洗脫峰的鏡檢結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)其在0.10、 0.40、 0.60 mol·L-1處的小洗脫峰并無菌體的存在(見圖2(f))； 奇異變形桿菌及克雷伯肺炎桿菌的出峰位置(0.30 mol·L-1)一致, 其余小峰鏡檢結(jié)果未觀察到菌體(見圖2(g), (h))； 大腸桿菌也出現(xiàn)了前后兩個(gè)色譜峰, 以0.50 mol·L-1為細(xì)菌峰, 0.10 mol·L-1處的鏡檢結(jié)果未觀察到菌體(見圖2(i)).圖2各色譜圖中出現(xiàn)的小峰, 其鏡檢結(jié)果均未觀察到菌體細(xì)胞的存在, 可能是260 nm處有吸收峰的蛋白質(zhì).與圖1(a)(線性梯度線脫)及圖1(d)(階梯式梯度洗脫)中的腸道模式混合菌株相一致的是, 單菌的色譜表征結(jié)果共有5種含有細(xì)菌的洗脫峰.

2.3　5個(gè)洗脫組分的確認(rèn)

為確認(rèn)收集到的洗脫組分是否為細(xì)菌, 對(duì)圖1(d)中收集得到的各個(gè)洗脫峰按照革蘭氏染色法進(jìn)行顯微鏡檢查, 其中P1～P5共5個(gè)明顯的洗脫組分的鏡檢結(jié)果如圖3所示, 視野中分布著許多菌體細(xì)胞.而其他小峰并未觀察到菌體細(xì)胞, 分析可能是一些在260 nm處有吸收峰的蛋白質(zhì)成分.根據(jù)圖3的鏡檢結(jié)果, 并結(jié)合圖1(d)腸道菌群模式混合菌株的色譜圖、 圖2中各單菌的色譜表征結(jié)果以及表1和表2中各種色譜峰的保留時(shí)間, 可以得出以下結(jié)論： P1為金黃色葡萄球菌(G+, 紫色)和脆弱擬桿菌(G-, 紅色)； P2為鼠李糖乳桿菌和青春雙歧桿菌(G+, 形態(tài)相似)； P3為糞腸球菌(G+, 紫色)； P4為克雷伯肺炎桿菌(G-, 紅色)、 奇異變形桿菌(G-, 紅色)和產(chǎn)氣莢膜梭菌(G+, 紫色)； P5為產(chǎn)氣莢膜梭菌(G+, 紫色)和大腸桿菌(G-, 紅色).出峰位置一致的細(xì)菌可能是由于這些細(xì)菌的表面電荷特性相近, 造成與離子交換劑吸附力的微小差異而無法分開[13-15].

圖3　洗脫組分鏡檢圖(100×油鏡)Fig.3　Microscope graph of the eluted fractions (100× oil immersion lens)

2.4　重復(fù)性試驗(yàn)

各目的菌5次重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表1和表2.11種HPLC色譜表征(2種腸道模式混合菌株、 9種單菌)的5次重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于1%, 說明本研究建立的HPLC分離分析腸道模式菌株的方法具有良好的重現(xiàn)性.

表1　不同洗脫條件下腸道模式混合菌的重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

表2　不同洗脫濃度下細(xì)菌的重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

注： 以各洗脫峰對(duì)應(yīng)洗脫液的NaCl濃度表示其出峰位置

2.5　HPLC分離細(xì)菌的靈敏度及其吸附量分析

為探討HPLC分離分析腸道模式混合菌株的檢測靈敏度及最大吸附量, 選取鼠李糖乳桿菌作為研究對(duì)象, 調(diào)節(jié)鼠李糖乳桿菌的濃度及其上樣量并進(jìn)行色譜表征.

如圖4(a)所示, 當(dāng)鼠李糖乳桿菌的上樣濃度為培養(yǎng)菌液(OD600=0.576)的5倍、 上樣量為505 μL時(shí), 開始出現(xiàn)穿透峰, 隨著上樣濃度及上樣量的增加, 穿透峰的面積逐漸增大, 洗脫峰的面積基本不再增加, 甚至由于離子交換樹脂吸附過載使得洗脫峰面積減小； 該濃度及上樣量下, 色譜柱的吸附量達(dá)到最大.如圖4(b)所示, 鼠李糖乳桿菌的上樣濃度為OD600=0.576(標(biāo)準(zhǔn)菌液)、 上樣量為20 μL時(shí), 該樣品信號(hào)強(qiáng)度低于0.05 AU, 但其色譜圖中出現(xiàn)了明顯的洗脫峰, 峰型對(duì)稱而尖銳、 基線低； 該濃度及上樣量下, 經(jīng)5次試驗(yàn)反復(fù)收集得到的洗脫組分鏡檢觀察到的菌體細(xì)胞非常的微量.為更加高效地分離回收菌體細(xì)胞、 區(qū)分蛋白峰和細(xì)菌峰, 選定上述上樣濃度及上樣量范圍為HPLC方法分離分析腸道菌群的有效檢測范圍.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 本檢測范圍內(nèi)建立的HPLC方法檢測靈敏度高、 重現(xiàn)性好； 色譜柱的上樣濃度為培養(yǎng)菌液(OD600=0.576)的5倍時(shí), 其最大上樣量為500 μL.

圖4　不同上樣量鼠李糖乳桿菌色譜圖Fig.4　Chromatograms of the L.rhamnosus in different injection volume

2.6　HPLC上樣前后菌體狀態(tài)分析

采用革蘭氏染色法將各個(gè)單菌HPLC上樣前后的菌體細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡觀察, 發(fā)現(xiàn)其中8種單菌HPLC上樣前后, 除了菌體密度變化外, 菌體狀態(tài)并無明顯差異.但是鼠李糖乳桿菌的菌體狀態(tài)發(fā)生了明顯的變化, 如圖5所示.圖5(a)為鼠李糖乳桿菌上樣前的鏡檢圖, 從中可看到菌體呈短小的雙桿狀, 頭尾相連、 規(guī)則排列.圖5(b)為鼠李糖乳桿菌HPLC色譜分離后收集得到的洗脫組分鏡檢圖, 分散在顯微鏡視野中, 菌體呈雙桿狀、 單桿狀.這可能是隨著洗脫液的稀釋作用使菌濃降低(c

圖5　鼠李糖乳桿菌HPLC上樣前后鏡檢圖(100×油鏡)Fig.5　Microscope graph of the L.rhamnosus before/after the HPLC analysis (100× oil immersion lens)

3　結(jié)語

本研究采用高效液相色譜分離分析腸道模式混合菌株, 對(duì)其洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化, 顯著提高了層析效果及其分辨率.最終確定了采用HPLC分離分析腸道模式菌株的最佳洗脫條件： 階梯式梯度洗脫, 洗脫時(shí)長共計(jì)100 min, 細(xì)菌樣品進(jìn)樣后, 0～10 min用A液平衡, 使樣品中的細(xì)菌充分吸附到色譜柱上； 10～60 min分別用含0.10、 0.15、 0.20、 0.25和0.30 mol·L-1NaCl的洗脫液各洗脫10 min； 60～100 min用0.40～0.70 mol·L-1洗脫液各洗脫10 min.腸道模式混合菌株經(jīng)過高效液相色譜分離得到5個(gè)明顯含有細(xì)菌的洗脫峰組分, 結(jié)合5個(gè)洗脫峰組分的鏡檢結(jié)果和各單菌的色譜圖, 分析可知9種腸道模式菌株的出峰位置(洗脫液中NaCl的濃度)分別為0.10 mol·L-1(脆弱擬桿菌和金黃色葡萄球菌)、 0.20 mol·L-1(青春雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌)、 0.25 mol·L-1(糞腸球菌)、 0.30 mol·L-1(奇異變形桿菌、 克雷伯肺炎桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌)以及0.50 mol·L-1(大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌).色譜柱的上樣濃度為培養(yǎng)菌液(OD600=0.576)的5倍時(shí), 其最大上樣量為500 μL.

腸道模式混合菌株中有些細(xì)菌的洗脫峰保留時(shí)間僅有微小的差異, 并且具有良好的重現(xiàn)性.嘗試通過縮小洗脫液濃度變化來進(jìn)一步分離這些細(xì)菌, 但是其洗脫峰位置并沒有發(fā)生改變.由此可以推斷出, 這些出峰位置類同的細(xì)菌具有相似的表面電荷特性[13-15].以上HPLC技術(shù)用于腸道模式混合菌株的分離純化工作, 為腸道菌群樣品中細(xì)菌細(xì)胞的分離回收、 總DNA的有效提取、 PCR擴(kuò)增效果的提高等奠定了前期基礎(chǔ).

液相色譜技術(shù)用于細(xì)菌純種、 混合物、 腸道菌群以及發(fā)酵食品特定生產(chǎn)菌株的分離、 分析已有研究, 但對(duì)該方法的了解和應(yīng)用目前尚處于發(fā)展初期.本課題組將傳統(tǒng)上用于研究蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的高效液相色譜作為腸道模式菌株的分離檢測技術(shù), 并實(shí)現(xiàn)目標(biāo)菌體細(xì)胞的分離回收和分析, 以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中大鼠腸道菌群的分析提供快速、 準(zhǔn)確、 可定量的分離檢測手段, 從而揭示腸道菌群的組成和動(dòng)態(tài)變化.該方法的建立, 可望為糞菌移植、 益生菌開發(fā)以及與腸道菌群相關(guān)的疾病研究提供方法學(xué)上的支持, 為環(huán)境監(jiān)測、 食品安全監(jiān)測以及疾病監(jiān)測等與人們生活息息相關(guān)的領(lǐng)域提供新的技術(shù), 具有極其廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域和發(fā)展前景.