酶解—高壓均質制備高溶解性、高消化率豆乳粉工藝

尋崇榮，范志軍，王冬梅，王中江，江連洲，李　楊

(1 東北農業大學食品學院，哈爾濱　150030；2 黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責任公司，哈爾濱　150036)

高壓均質技術被廣泛的應用于食品工程中。高壓均質過程同時涉及空化、剪切、湍流和溫升等問題。研究表明，高壓均質會影響蛋白質的三級和四級結構，但對大多數的球狀蛋白質的二級結構影響較小[12]，可與蛋白互補，限制性酶解可在一定程度上改變蛋白的二級結構[13]及功能特性，如溶解性和乳化能力[14-16]。而有研究表明，高壓均質輔助堿性蛋白酶限制性酶解處理大豆球蛋白，可改善其功能特性[17]，此外，高壓均質輔助胃蛋白酶酶解大豆分離蛋白，可得到更多的柔性蛋白及可溶性蛋白聚集體，提高大豆分離蛋白的溶解性、乳化性等功能特性[18]。

目前，已有研究報道了單獨采用酶解法或高壓均質法提高豆乳粉的溶解性，然而采用酶解聯合高壓均質提高豆乳粉溶解性的研究尚未見報道。本文以傳統濕法加工技術制備豆乳粉為基礎，利用酶解—高壓均質法以改善豆乳粉的溶解性，通過響應面優化分析法對酶解—高壓均質工藝進行優化，以改善豆乳粉的溶解性；對豆粉的粒徑及顯微結構進行分析，為速溶性豆乳粉的生產加工提供科學依據。

1　材料與方法

1.1　材料

大豆，哈爾濱九三油脂集團；大豆磷脂，周口慧洋飼料有限公司；Protex-6L堿性蛋白酶(酶活力1.0×105U/g)，丹麥novo公司；實驗所需基礎試劑均為分析純，北京化學試劑公司。

1.2　儀器

FDM-Z80豆漿機，上海偉業儀器廠；FPG12800E.N00實驗型高壓均質機，島津公司；噴霧干燥機，無錫昂益達機；Zetasizer Nano-ZS90光散射粒徑分析儀，英國Malvern公司；AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；pHS-25型酸度計，上海江儀儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，余姚市東方電工儀器廠；XW-80A旋渦混合器，上海青浦滬西儀器廠；HYP-Ⅱ八孔消化爐，上海纖檢儀器有限公司；LNK-871型凱氏定氮快速自動蒸餾器，江蘇省宜興市科教儀器研究所；Olympus U182/U1S光學顯微鏡，Copyright 奧林巴斯有限公司。

1.3　豆乳粉的制備

大豆→浸泡→熱燙→磨漿→漿渣混合物→漿渣分離→豆乳→酶解→滅酶→高壓均質→調配→濃縮→噴霧干燥→豆乳粉。參照齊寶坤等[3]的方法稱取50g大豆于燒杯中，用濃度為0.5%的NaHCO3水溶液浸泡10 h左右后用沸水熱燙5min，按豆水比1∶7的比例添加90℃的去離子水進行磨漿得漿渣混合物，然后漿渣分離得豆乳，調節豆乳溫度，用0.1mol/L的HCL和NaOH調節pH，加入Protex-6L堿性蛋白酶進行酶解，酶解后95℃滅酶5min，對酶解后的豆乳進行高壓均質處理后，添加2%的乳化劑大豆磷脂進行調配混勻，將調配好的豆乳進行真空濃縮至豆乳固形物含量達15%左右，然后在進口溫度為185℃、出口溫度為85℃條件下進行噴霧干燥即得豆乳粉。

1.4　酶解工藝的單因素試驗

保持均質壓力為150 MPa、均質次數2次、酶解溫度為54℃、酶解時間為1.5 h、酶解pH為9、酶添加量為1.5%為基礎工藝，分別選取酶解溫度為45、50、55、60、65℃，酶解時間為0.5、1、1.5、2、2.5 h，酶解pH為7、8、9、10、11，酶添加量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%進行單因素試驗。通過蛋白質分散指數(%)和蛋白質消化率(%)比較分析確定酶解工藝單因素最優條件。

1.5　高壓均質工藝的單因素試驗

保持酶解溫度為54℃、酶解時間為1.5 h、酶解pH為9、酶添加量為1.5%、均質壓力為150 MPa、均質次數2次為基礎工藝。在其他條件不變的情況下，分別選取均質壓力為50、100、150、200、250 MPa，均質次數為1、2、3、4、5次，進行單因素試驗。通過蛋白質分散指數(%)和蛋白質消化率(%)比較分析確定高壓均質處理工藝單因素最優條件。

1.6　蛋白質分散指數的測定

參照齊寶坤等[3]的方法取一定量豆乳粉樣品以1∶20的料液比分散于去離子水中，充分攪拌30min，待分層后將溶解液于3 000r/min下離心10min，離心后取上清液測定蛋白含量(凱氏定氮法)。計算公式如式(1)：

(1)

1.7　體外模擬胃腸道消化試驗

參照夏明敬[5]的方法，稱取2g豆粉溶于100mL去離子水中，在37℃的浴鍋中預熱10min。用1mol/L的HCl調節pH為3.0，加入50U/g的胃蛋白酶和75U/g的凝乳酶不斷攪拌水解1h后用1mol/L的NaOH調節pH為7.0。然后加入1 000U/g的胰蛋白酶，不斷攪拌2h，到時間后經沸水浴滅活5min。取10mL消化好的樣品，加入等體積的10%的三氯乙酸沉淀蛋白，然后在4 000r/min條件下離心10min。取上清液，釆用凱氏定氮法測定可溶性蛋白的含量。蛋白質白化率計算公式如式(2)：

(2)

1.8　豆粉乳液的粒徑分布

用Zetasizer Nano-ZS 90光散射粒度分析儀分別測定傳統濕法制備、最佳酶解及最佳酶解—高壓均質工藝制備的豆粉乳液的粒徑分布規律，樣品折射率設置為1.5，溶液折射率設置為1.33。為了降低多重光散射效應，分析前用去離子水稀釋豆乳粉5 000倍測粒徑。

1.9　豆乳粉的光學顯微鏡觀察

通過光學顯微鏡分別對傳統濕法工藝、最佳酶解工藝、最佳高壓均質工藝及最佳酶解—高壓均質工藝噴霧干燥后的豆乳粉進行觀察。分別用去離子水將上述豆乳粉稀釋10倍后，經旋渦混合器震蕩10s，吸取混合后的豆粉乳液于載玻片上，蓋上載玻片后進行顯微鏡觀察。

1.10　數據處理

每組試驗都進行3次平行試驗，并進行誤差分析。采用SPASS 18對實驗數據進行方差分析、相關性和差異顯著性分析；采用Origin 8.5軟件進行作圖；采用Design-Expert軟件進行響應面數據分析及方差分析。

2　結果與分析

2.1　酶解工藝單因素試驗

2.1.1酶解溫度對蛋白質分散指數和蛋白質消化率的影響由圖1可知，當酶解溫度從45℃升高到55℃時，豆粉蛋白質分散指數和蛋白質消化率隨溫度的升高而顯著增加(P<0.05)，酶解溫度為55℃時，蛋白質分散指數和蛋白質消化率達到最大；繼續升高酶解溫度，蛋白質分散指數和蛋白質消化率均有降低趨勢。該結果與齊寶坤等[3]、田杰等[24]的研究結果一致，即酶解可提高大豆分離蛋白的蛋白質分散指數和體外消化率，但溫度低于或高于最適酶解溫度時會降低蛋白質分散指數和蛋白質消化率。原因是Protex-6L堿性蛋白酶的最適酶解溫度在55℃左右，在該酶解溫度范圍內酶解效果較好，當低于或高于該溫度時會降低Protex-6L堿性蛋白酶的催化活性，降低蛋白質分散指數和蛋白質消化率。說明適度的酶解利于人體吸收利用，改善豆乳粉的營養價值。綜合考慮，選擇酶解溫度為55℃。

2.1.2酶解時間對蛋白質分散指數和蛋白質消化率的影響由圖2可知，當酶解時間由0.5h增加到1.5h時，蛋白質分散指數和蛋白質消化率隨著酶解時間的增加而顯著性增加(P<0.05)，而超過1.5h后繼續增加酶解時間，蛋白質分散指數和蛋白質消化率變化不明顯。原因是酶解初期底物相對含量較高，酶與底物接觸充分，利于酶促反應的進行，提高豆乳粉的蛋白質分散指數和蛋白質消化率；但隨著酶解時間的繼續延長，底物相對含量不斷減少，產物相對含量增加，酶解產物與底物產生競爭性抑制，酶促反應達到平衡，導致蛋白質分散指數和蛋白質消化率變化不明顯[22，24]。綜合考慮，選擇酶解時間為1.5 h。

2.1.3酶解pH對蛋白質分散指數和蛋白質消化率的影響由圖3可知，當酶解pH從7.0升高到9.0時，豆粉蛋白質分散指數和蛋白質消化率隨溫度的升高而顯著增加(P<0.05)，酶解pH為9.0時，蛋白質分散指數和蛋白質消化率達到最大；繼續升高酶解pH，蛋白質分散指數和蛋白質消化率均有降低趨勢。原因是Protex-6L堿性蛋白酶的最適酶解pH在9.0左右，在該酶解pH時酶解效果較好，當低于或高于該pH時會改變酶分子構象，降低Protex-6L堿性蛋白酶的催化活性，抑制酶促反應，從而降低蛋白質分散指數和蛋白質消化率[15，24]。綜合考慮，選擇酶解pH為9。

2.1.4酶添加量對蛋白質分散指數和蛋白質消化率的影響由圖4可知，當酶添加量從0.5%升高到1.5%時，豆粉蛋白質分散指數和蛋白質消化率隨著酶添加量的增加而顯著增加(P<0.05)，當加酶量達到1.5%時，蛋白質分散指數和蛋白質消化率達到最大；繼續增加酶添加量，蛋白質分散指數和蛋白質消化率有下降趨勢。原因是相對底物含量的限制及酶分子之間相互碰撞減少了底物與酶碰撞機會，降低酶促效應，導致蛋白質分散指數和蛋白質消化率下降，這與徐錦麗[23]的研究結果一致，即適度增加酶添加量可改善大豆蛋白的溶解性及消化利用率。綜合考慮，確定酶添加量為1.5%。

圖1　酶解溫度對蛋白質分散指數和蛋白質消化率的影響

圖2　酶解時間對蛋白質分散指數和蛋白質消化率的影響

圖3　酶解pH對蛋白質分散指數和蛋白質消化率的影響

圖4　酶添加量對蛋白質分散指數和蛋白質消化率的影響

2.2　高壓均質工藝單因素確定試驗

由圖5可知，當均質壓力從50MPa升高到150MPa時，豆粉蛋白質分散指數和蛋白消化率隨著均質壓力的增加而顯著增加(P<0.05)。這是由于豆乳中的蛋白、油滴等相互聚集的大顆粒在高壓均質的高速剪切作用下均勻分散，降低大分子之間的纏繞作用，使豆乳的表觀黏度下降，促進蛋白質的水化作用，使其溶解度增大[20]。而在高壓均質的高速剪切作用下大豆蛋白的剛性結構逐漸展開，柔性增加，暴露出更多的極性基團和疏水基團，蛋白質顆粒的表面電荷分布加強，也提高了蛋白質的水化作用及乳化作用，以致蛋白質分散指數提高，豆粉粒徑可能減小，促進蛋白的消化吸收[20]。綜合考慮，選擇均質壓力為150MPa。

由圖6可知，當均質次數對豆粉蛋白質分散指數及蛋白消化率的影響不顯著時(P>0.05)，說明增加均質次數對豆粉的品質影響不大。綜合考慮蛋白質分散指數、表觀粘度的變化及加工成本，選擇均質次數為2次。

2.3　豆粉乳液粒徑的對比分析

由圖7可知，與傳統濕法工藝相比，經酶解及酶解—高壓均質工藝制備的豆粉乳液粒徑減小且經酶解—高壓均質工藝制備的豆粉乳液只有1個單峰，粒徑最小，粒徑分布范圍最窄。原因可能是酶解使蛋白降解為小分子肽，暴露出更多的疏水基團，蛋白分子由球狀剛性結構伸展為柔性結構，提高了蛋白的界面活性，降低油水界面的張力，在乳化過程中形成粒徑細小的乳液滴，經噴霧干燥得到較小粒徑的豆乳粉，豆粉乳液粒徑減小；而高壓均質的強剪切力、撞擊、空穴效應可進一步改善蛋白的表面疏水性、界面活性及乳化性，使酶解后的豆粉乳液更加分散，粒徑減小、分布均一[21，25]。而粒徑對豆粉的溶解性和豆粉乳液的表觀粘度有重要影響。由斯托克斯定律知，液滴移動速度與其半徑平方成正比，因此豆粉乳液的溶解性及表觀粘度可能與液滴粒徑有關，粒徑越小，豆粉乳液的溶解性越強[26-27]。

2.4　豆粉溶液的顯微觀察

由圖8可知，傳統濕法工藝制備的豆乳粉經溶解混合后，顯微圖像顯示出部分乳液液滴聚集，豆乳顆粒分布不均勻；相比較傳統濕法工藝，經酶解工藝制備的豆粉乳液液滴聚集較少，豆乳顆粒分布較均勻，粒徑較小；而酶解—高壓均質工藝制備的豆粉乳液粒徑最小，豆乳顆粒均勻分布且沒有乳液液滴聚集現象。進一步說明酶解可改善豆乳粉的溶解性，而高壓均質處理對酶解有輔助效果，可提高蛋白的乳化性及表面活性以進一步提高豆乳粉的溶解性及分散性。

圖5　均質壓力對蛋白質分散指數和蛋白消化率的影響

圖6　均質次數對蛋白質分散指數和蛋白消化率的影響

圖7　不同豆粉乳液的粒徑分布

圖8　100倍物鏡下不同豆乳粉溶液的顯微圖像

3　結論

本文對高壓均質輔助酶解制備高溶解性豆乳粉工藝進行研究，分別采用離心法、體外模擬胃腸道消化、光散射粒度分析儀及光學顯微鏡測定豆乳粉的蛋白質分散指數、蛋白質消化率，分析豆粉粒徑分布及顯微觀察。單因素試驗表明，均質壓力、均質次數、酶解溫度、酶解時間、酶解pH、酶添加量對豆乳粉蛋白質分散指數具有顯著影響。與未經均質及酶解處理的傳統豆乳粉(蛋白質分散指數為79.16%[3])相比，高壓均質輔助酶解工藝顯著提高了豆乳粉的溶解性及蛋白質消化率，減小了豆粉平均粒徑，其蛋白質分散指數提高了近14%。◇