三個茯苓品種氨基酸與蛋白質的含量比較

楊　嵐，尹火青，唐　娟，袁　濤，楊煥治，陳三春，張　城，彭國平1，，3

(1 湖南農業大學生物科學技術學院，長沙　410128；2 湖南省博世康中醫藥有限公司，湖南懷化　418000；3 道地藥用植物規范化栽培與綜合利用湖南省工程實驗室，長沙　410128)

茯苓是多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，載于《中國藥典》中，作為我國傳統的藥食兩用的中藥已有2 000多年的悠久歷史，茯苓的主要研究集中在其次生代謝產物上，研究最多的是茯苓多糖，茯苓多糖及其衍生物羧甲基茯苓多糖具有調節免疫力[1]、抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、調節血糖[4]、降血脂[5]和保肝[6]等藥理作用。對茯苓中含量少的蛋白質和氨基酸的研究較少，僅有許輔等[7]對茯苓的一種新型免疫調節蛋白的純化與生理活性在巨噬細胞體外誘導的腫瘤壞死因子有關的基因表達的初步研究。因此，本實驗分析了3個茯苓品種蛋白質與氨基酸的含量，為茯苓蛋白質類的藥效研究以及茯苓蛋白類保健品產品開發奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　材料、儀器與試劑

茯苓材料為“野生型”“湘靖28”“輻射一號”新鮮茯苓菌核，“湘靖28”是在“野生型”中選育出來的，“輻射一號”是輻射育種得到的材料，均同時采自湖南省靖州縣茯苓基地同一塊地。

R-1001N旋轉蒸發儀，鄭州長城科工貿有限公司；722N可見分光光度計，上海精科；KQ-3200E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；全自動凱氏定氮儀，Unit，FOSS TecatorTMDigestor Auto；5417R冷凍高速離心機，德國Eppendorf公司；L-8900日立全自動氨基酸分析儀，KjeltecTM8400 Analyzer；牛血清蛋白，考馬斯亮藍G-250，其余化學試劑均為國產AR級。

1.2　試驗材料處理

將3個品種的新鮮茯苓菌核分別切薄片，45℃恒溫干燥至恒重并粉碎，100目篩子過篩備用。

1.3　蛋白質標準曲線的制作

精密配置0.5mg/mL的牛血清蛋白標準品溶液，按照稀釋倍數原則分別將其稀釋，取14支10mL具塞刻度試管編號，分別加入牛血清蛋白標準液，配置標準液濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL，每個試管標號做3個平行組。在每個試管中加入5.0mL現配的考馬斯亮藍G-250，混勻靜置 3min，用722N可見分光光度計在595 nm處比色，記錄溶液吸光度繪制蛋白質標準曲線，得到回歸方程。

1.4　茯苓蛋白質的提取與測定

1.4.1醇溶性蛋白的提取精密稱取茯苓干粉末5g于研缽中，加15mL 50%乙醇，研磨成勻漿，轉移到50mL離心管中，4℃、12 000r/min常溫超聲振蕩20min，高速冷凍離心20min。取上清液，即為蛋白質粗提液。

1.4.2水溶性蛋白的提取精密稱取茯苓干粉末5g于研缽中，加15mL蒸餾水，研磨成勻漿，轉移到50mL離心管中，常溫超聲振蕩20min，4℃、12 000r/min高速冷凍智能離心20min后取上清液，為蛋白質粗提液。

1.4.3茯苓總蛋白的測定凱氏定氮法測定：精密稱取1g茯苓干粉末于消化管中，按順序依次加入催化劑CuSO40.5g、K2SO410g和濃H2SO420mL，置于反應器上消化，時間180min，消化溫度410℃，打開空氣過濾器，計算3個茯苓樣品蛋白質的百分含量。

1.4.4茯苓醇溶性蛋白的測定 考馬斯亮藍法測定[8]：取蛋白質粗提液1mL，對照組用1mL超純水代替蛋白質粗提液并編號，加入5mL考馬斯亮藍G-250后混勻靜置3min，用722N可見分光光度計在595 nm處測定吸光度。

1.4.5茯苓水溶性蛋白的測定 考馬斯亮藍法測定：采用真空低溫蒸餾法[9]將蛋白質粗提液濃縮5倍，取1mL蛋白質濃縮液于試管中并編號，對照組用1mL超純水代替蛋白質濃縮液，加入5mL考馬斯亮藍G-250后混勻靜置3min，用722N可見分光光度計在595 nm處測定吸光度。

1.5　茯苓樣品中氨基酸的檢測

1.5.1氨基酸測定茯苓氨基酸按GB/T 5009.124—2003測定，每個樣品準備10g。

1.5.2樣品預處理精密稱取3份等量的茯苓干粉末，置于水解管中冰浴30min，加入2mL預先冷卻的過甲酸溶液，0℃靜置18 h，加入氫溴酸0.3mL，于0℃搖勻靜置30min，通入氮氣1min，放入110℃的恒溫干燥箱中水解24 h，冷卻至室溫，加超純水定容至100mL容量瓶，混合均勻后加入2mL 0.02mol/L的鹽酸溶液，用0.2μm的濾膜過濾，濾液上機檢測。

1.5.3進樣檢測設置檢測波長為570 nm，其中設置脯氨酸檢測波長為440 nm。根據日立公司的使用手冊配制標準，泵1(洗脫溶液)，流速0.40mL/min(壓力2.0～14.7 MPa)；泵2(茚三酮溶液)，流速0.35mL/min(壓力2.0～14.7 MPa)；分析柱溫度57℃；反應溫度135℃；進樣體積20μL。樣品測定完后系統自行清洗，最后進行數據處理并打印報告。

2　結果與分析

2.1　茯苓氨基酸測定結果

在本研究中，未檢出的酪氨酸(Tyr)和半胱氨酸(Cys)是由于該儀器原因檢測的此2種氨基酸含量具有不可靠性，并非是指該測試樣品中不含此2種氨基酸，故剔除Tyr和Cys的結果。經氨基酸全自動檢測儀檢測(表1)，3個茯苓樣品中各氨基酸含量除個別氨基酸Ala、Arg、Lys外，含量高低都符合野生型>輻射一號>湘靖28的規律，3個品種的茯苓所含氨基酸種類齊全，輻射一號的8種必需氨基酸含量較豐富，盡管出現了一定差異，但基本在同一個數量級。

表1　3個茯苓品種的氨基酸檢測結果單位：g/100g

表2　3個茯苓品種的蛋白含量單位：mg/g

2.2　蛋白質含量測定結果

(1)蛋白質標準曲線[10]：牛血清蛋白標準曲線的方程為Y=0.076X+0.02，R2=0.997 9，R2>0.99 5，其線性相關性好。(2)總蛋白含量測定：用凱氏定氮法分別測得3個茯苓品種的總蛋白含量如表2，總蛋白含量高低為野生型>湘靖28>輻射一號，輻射一號與湘靖28在總蛋白含量上差異不明顯。(3)醇溶性蛋白含量測定：用考馬斯亮藍G-250法測得吸光度值，依據蛋白質標準曲線計算得到醇溶性蛋白含量高低為野生型>輻射一號>湘靖28，輻射一號與湘靖28的醇溶性蛋白含量高低與水溶性蛋白含量高低并不成一致的相關性。(4)水溶性蛋白含量測定：用考馬斯亮藍G-250法測得其吸光度，依據蛋白質標準曲線計算得出水蛋白質含量如表2，3個茯苓品種水溶性蛋白含量高低為野生型>湘靖28>輻射一號，與總蛋白含量成一致的規律。(5)在提取茯苓蛋白質時，因為茯苓樣品中蛋白質含量很低，需要研磨充分，超聲輔助提取，用低濃度乙醇提取所得蛋白質的含量相對較高，這與濃縮過程中蛋白質降解有關。

3　討論與結論

至今被公認的茯苓的主要功效成分是茯苓多糖和三萜類化合物，對于茯苓中的蛋白質和氨基酸等含量較低的成分研究應用較少，對茯苓的研究不是很完善，不利于闡述茯苓的功效并開展實際應用。本實驗比較了3個茯苓品種的氨基酸與蛋白質的含量，結果顯示，蛋白質差異不明顯，在氨基酸含量方面，傳統的野生型最具明顯優勢，輻射一號優于湘靖28，輻射一號總蛋白和游離氨基酸含量高于湘靖28；從新品種選育來看，輻射一號是營養價值相對高、保健作用最好的材料，是相對較優的品種，可以作為新品種進行推廣。蛋白質和游離氨基酸的含量比較可更為全面地評價和控制中藥茯苓的質量，而茯苓中蛋白質的研究是一個值得關注的新方向，為茯苓新品種選育和茯苓保健品研究奠定基礎。◇