石菖蒲醇提物對SH-SY5Y細胞增殖及抗氧化損傷作用*

★ 魏飛亭　董嘉皓　唐怡　李斐　陳洋　陳海芳　楊武亮　袁金斌*（江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌 330004）

阿爾茨海默病，又稱老年癡呆，是一種神經退行性疾病，臨床表現為記憶功能下降，日常生活自理能力減退，并伴有各種神經精神癥狀和行為障礙。目前此疾病的發病機制尚未明確，但是過度的氧化應激損傷被認為是其重要的原因之一［1］。H2O2是體內氧化代謝的中間產物，極易通過細胞膜進入細胞，產生高活性的自由基，進而損傷細胞器，導致細胞功能障礙，而神經細胞的過氧化氫酶活性低，使其比其他類細胞更容易受到氧化損傷［2］。人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞，來源于1970年建立的SH-N-SH細胞系經三次克隆后的亞系。其形態、生理及生化功能與正常神經細胞相似，作為擬神經細胞模型，被廣泛用于神經退行性疾病的研究中［3］。

石菖蒲為天南星科植物石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）的干燥根莖［4］，具有鎮靜、抗抑郁、神經保護等作用于神經系統的藥理活性［5］，其在神經系統性疾病的防治中具有廣泛的應用前景。現階段對石菖蒲的神經系統藥理作用的研究中，大多以揮發油和水提物為研究對象［6-8］，而對醇提物鮮有提及。本文以石菖蒲醇提物為研究對象，用H2O2誘導SH-SY5Y細胞建立氧化應激損傷模型，探討石菖蒲醇提物對SH-SY5Y細胞增殖的影響和對H2O2引起的細胞損傷的保護作用，為石菖蒲用于氧化應激相關的神經退行性疾病的治療及研究提供理論依據。

1　實驗材料

1.1藥材與試劑 石菖蒲藥材采自于江西南昌，經江西中醫藥大學舒積成副教授鑒定為天南星科植物石菖蒲Acori tatarinowii Schott的干燥根莖。DMEM/F12（1∶1）培養基、牛胎血清、青霉素-鏈霉素（美國GIBCO公司）；0.25%胰蛋白酶、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（北京索萊寶科技有限公司）；30 %過氧化氫（西隴化工股份有限公司）；0.22μm微孔濾膜（廣州潔特生物過濾股份有限公司）。

1.2儀器 CO2細胞培養箱（美國Thermo Fisher公司）；SIGMA3-18K高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；XDS-1B倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；ELx800紫外可見光酶標儀（美國BioTek公司）；96孔板（美國Corning公司）。

1.3細胞 SH-SY5Y細胞，購自中科院上海細胞庫。SH-SY5Y細胞培養于含10 %滅活胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12（1∶1）培養液中。于37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養，待細胞生長至鋪滿培養基底部70%～80%時，用0.25%胰酶消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

2　方法

2.1藥液的配置 石菖蒲藥材凈制，放入60℃烘箱，烘2h，粉碎，稱取約50g（過二號篩），置于1000mL圓底燒瓶中加入500mL 70%乙醇，回流2h，趁熱抽濾，藥渣再重復提取2次，合并濾液，濃縮，將濃縮液置于-80℃中冷凍12h，制成凍干粉，再精密稱取石菖蒲凍干粉適量，用培養基配制成含藥培養基，過0.22μm濾膜，于4℃避光保存，備用。

2.2不同濃度石菖蒲培養基對細胞增殖的影響 取對數生長期的SH-SY5Y細胞，制成濃度為1×104個/mL的細胞液，接種至96孔板，每孔200μL，培養24h后，小心吸棄培養液。設置石菖蒲組、對照組和調零組。石菖蒲組加入200μL不同濃度的含藥培養基（0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00g/L，同一濃度設置6個復孔）；對照組常規加入等量培養基，不含石菖蒲醇提物；調零組加入終體積的培養基，不含細胞和石菖蒲醇提物。培養24h后，每孔加入20μL的MTT，37℃避光孵育4 h，小心吸棄培養液，加入100μL DMSO，震蕩，用酶標儀于490 nm處測定吸光度值（A），計算細胞存活率。

2.3H2O2誘導SH-SY5Y細胞氧化損傷模型的建立 取對數生長期的SH-SY5Y細胞，制成濃度為1×104個/mL的細胞液，接種至96孔板，每孔200 μL，培養24h后，小心吸棄培養液。設置模型組、對照組和調零組。模型組［9］加入H2O2致終濃度為200μmol/L；對照組用等量的空白培養基代替H2O2溶液；調零組加入終體積的培養基，不含細胞和H2O2。培養24h后，每孔加入20μL的MTT，37℃避光孵育4h，小心吸棄培養液，加入100μL DMSO，震蕩，用酶標儀于490 nm處測定吸光度值（A），計算細胞存活率。

2.4石菖蒲培養基對H2O2引起的SH-SY5Y損傷的保護作用 取對數生長期的SH-SY5Y細胞，制成濃度為1×104個/mL的細胞液，接種至96孔板，每孔200μL，培養24h后，小心吸棄培養液，并設置保護組、對照組、模型組和調零組。保護組加入200μL不同濃度的石菖蒲醇提物（0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00g/L，同一濃度設置6個復孔）；對照組和模型組用等量的空白培養基代替含藥培養基溶液；調零組加入終體積的培養基，不含細胞和石菖蒲醇提物。培養24h后，實驗組和模型組加入H2O2致終濃度為200μmol/L，對照組和調零組加入等體積的空白培養基，繼續培養24h后，每孔加入20μL MTT，37℃避光孵育4h，小心吸棄培養液，加入100μL DMSO，震蕩，用酶標儀于490nm處測定吸光度值（A），計算細胞存活率。

2.5數據處理及統計方法 細胞存活率計算方法如下（A實驗為石菖蒲組、模型組或保護組的吸光度）。使用分析軟件（Graphpad Prism 5.0）對各樣品數據進行統計學分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01有統計學意義。

細胞存活率=（A實驗-A調零）/（A對照-A調零）×100%

3　結果

3.1不同濃度的石菖蒲醇提物作用于SH-SY5Y細胞后的細胞存活率 與對照組相比較，SH-SY5Y細胞經不同濃度石菖蒲醇提物作用24h后，0.25g/L和0.50g/L組細胞數目增多，突觸增加，貼壁功能和折光性上升，其余組分細胞形態未有明顯改變。見圖1。根據吸光度計算細胞存活率，并對數據進行分析測算發現，藥物的各個濃度對細胞增殖的影響不同，見圖2。當石菖蒲醇提物濃度為0.25g/L和0.50g/L時，其對細胞增殖有顯著的促進作用（P＜0.01），而其他濃度下的藥物均無顯著促進作用或抑制作用（P＞0.05）。

圖1　不同濃度石菖蒲醇提物對SH-SY5Y細胞形態的影響

圖2　不同濃度石菖蒲醇提物對細胞存活率的影響

3.2石菖蒲培養基對H2O2引起的SH-SY5Y損傷的保護作用 與對照組相比，H2O2模型組細胞密度降低，突觸消失，胞膜破裂，細胞皺縮，細胞間隙增大。而預先加入不同濃度石菖蒲醇提物培育24h后再加H2O2的組分，其細胞形態與模型組相比較，損傷程度較輕微，細胞密度也較大，見圖3。

圖3　不同濃度石菖蒲醇提物對H2O2損傷的SH-SY5Y細胞形態的影響

各組分用MTT法檢測細胞存活率，并對數據進行分析測算，結果見圖4，由圖可知，與對照組相比，H2O2模型組SH-SY5Y細胞存活率明顯降低（P＜0.01），表明成功構建細胞損傷模型；與模型組相比，0.25g/L和0.50g/L的石菖蒲培養基組細胞存活率顯著提高（P＜0.01），表明0.25g/L和0.50g/L的石菖蒲培養基可對H2O2引起的細胞損傷起保護作用，且0.25g/L濃度下抗損傷效果最強。

圖4　不同濃度石菖蒲醇提物對H2O2損傷的SH-SY5Y細胞存活率的影響

4　討論

氧化應激是指機體在受到有害刺激的情況下，產生過多的活性氧自由基和活性氮自由基，使體內氧化和抗氧化系統失衡，導致細胞死亡和組織受損［1］。而H2O2是人體內重要的活性氧自由基之一，能夠與多種生物靶標分子反應，誘導細胞發生氧化損傷［2］。本實驗以H2O2體外培養SH-SY5Y細胞，建立氧化損傷模型。用MTT法和倒置相差顯微鏡評價細胞的存活和繁殖情況，同時考察了不同濃度石菖蒲醇提物對正常SH-SY5Y細胞增殖的影響和對H2O2誘導的SH-SY5Y細胞氧化損傷的保護作用。

發現當加入200μL濃度分別為0.25g/L和0.50g/L的石菖蒲醇提物培養基時，與對照組和模型組相比細胞的存活率均顯著升高（P＜0.01），而其他濃度的石菖蒲醇提物組并無顯著性促進、抑制或抗氧化損傷作用。表明石菖蒲醇提物在一定濃度下對SH-SY5Y細胞的生長有促進作用，且對H2O2誘導SH-SY5Y細胞的氧化損傷具有保護作用，即石菖蒲醇提物對于氧化應激相關的神經退行性疾病可能具有治療作用。