CYP3A5*3基因多態性對穩定期腎移植受者他克莫司血藥濃度及腎功能的影響

衛澤武　王學彬　張文文　楊云云　高麗紅　馬多玲　肖成武　王卓　高申

中圖分類號 R969.3；R699.2；R968 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）02-0183-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.02.10

摘 要 目的：探討細胞色素P450（CYP）3A5*3（rs776746）基因多態性對穩定期腎移植受者他克莫司（TAC）血藥濃度和腎功能的影響。方法：選擇1995年3月-2014年12月于我院行腎移植術并于術后接受以TAC為基礎的三聯抗排斥方案（TAC+麥考酚鈉+醋酸潑尼松）治療且行定期門診隨訪的穩定期腎移植受者98例，收集其2016年1-12月的隨訪信息。采用化學發光微粒子免疫分析法檢測腎移植受者的TAC血藥谷濃度，并計算經體質量和日劑量校正的標準化血藥濃度（C/D）值；采用干化學法檢測血肌酐（Scr）水平；采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法、直接測序法檢測CYP3A5*3基因分型。采用Kruskal Wallis H檢驗或Mann-Whitney U檢驗分析CYP3A5*3基因多態性與TAC的C/D值、Scr水平的相關性。結果：98例腎移植受者中，CYP3A5*3 *1/*1（AA）、*1/*3（AG）、*3/*3（GG）型分別有9、37、52例，各基因型頻率分別為9.18%、37.76%、53.06%，均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P>0.05）。不同基因型受者TAC血藥谷濃度比較，差異無統計學意義（P>0.05）；TAC劑量和C/D值比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。其中，CYP3A5*3 *3/*3型受者TAC劑量顯著低于*1/*3、*1/*1型受者，且*1/*3型受者顯著低于*1/*1型受者；*3/*3型受者TAC的C/D值顯著高于*1/*3、*1/*1型受者，且*1/*3型受者顯著高于*1/*1型受者，差異均有統計學意義（P<0.05）。不同基因型受者Scr水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論：CYP3A5*3基因多態性對我國穩定期腎移植受者TAC的血藥濃度有顯著影響，*3等位基因攜帶者TAC的C/D值更高，且每日所需的TAC劑量更低；但CYP3A5*3基因多態性可能與其Scr水平無關。

關鍵詞 CYP3A5*3基因；基因多態性；他克莫司；穩定期；腎移植；血藥濃度；腎功能

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the influence of CYP3A5*3（rs776746） genetic polymorphism on blood concentration of tacrolimus （TAC） and renal function in renal transplant recipients during the stable period. METHODS： A total of 98 renal transplant recipients during the stable period receiving TAC-based triple anti-rejection scheme （TAC+sodium mycophenol+prednisone acetate） after surgery and regular follow-up were selected from our hospital during Jan. 1995-Dec. 2014. The follow-up information during Jan.-Dec. 2016 was also collected. Trough concentration of TAC in renal transplant recipients was determined by chemiluminescence microparticle immuno assay. Standard blood concentration （C/D） was calculated after corrected with body weight and daily dose. Scr level was detected with dry chemistry method. CYP3A5*3 genotype was detected by PCR-RFLP and direct sequencing. The relationship of CYP3A5*3 genetic polymorphism with TAC C/D value and Scr level was determined by Kruskal Wallis H or Mann-Whitney U assay. RESULTS： Among 98 renal transplant recipients， there were 9 cases of CYP3A5*3 *1/*1（AA） genotype， 37 cases of *1/*3（AG） genotype and 52 cases of *3/*3（GG）genotype. The gene frequencies were 9.18%， 37.76%， 53.06%， which were all in line with Hardy-Weinberg equilibrium （P>0.05）. There was no statistical significance in trough concentration of TAC among different genotypes （P>0.05）. There was statistical significance in TAC dose and C/D value among different genotypes （P>0.05）. TAC dose of CYP3A5*3 *3/*3 genotype recipients was significantly lower than those of *1/*3 and *1/*1 genotype recipients； that of *1/*3 genotype recipients was significantly lower than that of *1/*1 genotype recipients. C/D value of *3/*3 genotype recipients was significantly higher than those of *1/*3 and *1/*1 genotype recipients； that of *1/*3 genotype recipients was significantly higher than that of *1/*1 genotype recipients， with statistical significance （P<0.05）. There was no statistical significance in Scr levels among different genotypes （P>0.05）. CONCLUSIONS： CYP3A5*3 genetic polymorphism significantly influences blood concentration of TAC in renal transplant recipients during the stable period， and *3 allele carriers have higher C/D values and need smaller TAC daily dose. CYP3A5*3 genetic polymorphism may be not associated with Scr level.

KEYWORDS CYP3A5*3 gene； Genetic polymorphism； Tacrolimus； Stable period； Renal transplantation； Plasma concentration； Renal function

他克莫司（Tacrolimus，TAC）屬鈣調磷酸酶抑制劑（Calcineurin inhibitor，CNI），是腎移植受者術后所用免疫抑制劑聯合給藥方案中的基礎藥物[1]。由于TAC治療窗窄、藥動學個體差異大，故穩定期腎移植受者必須定期隨訪，且TAC用藥劑量必須根據治療藥物監測（Therapeutic drug monitoring，TDM）結果不斷調整，使其血藥濃度維持在治療窗內[2]。TAC藥動學個體差異主要受細胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）同工酶CYP3A5酶活性的影響，而該酶活性很大程度上取決于CYP3A5*3單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP），即其第3內含子6986A>G（rs776746）堿基突變導致第109位提前出現終止密碼子，進而翻譯出無功能的CYP3A5蛋白，使得純合子攜帶者（*3/*3，非表達者）的酶活性低于*1/*3和*1/*1攜帶者（表達者）[3]。CYP3A5*3的SNP對我國腎移植受者TAC代謝的影響是明確的，即為達到相同水平的TAC靶濃度，腎移植受者攜帶CYP3A5*1等位基因（AA和AG型，即*1/*1和*1/*3型）比CYP3A5*3純合子（GG型，即*3/*3型）需要更高的TAC日劑量[4-5]。此外，腎移植受者需定期隨訪并監測血肌酐（Serum creatinine，Scr）水平，以評估其移植腎的功能[6]。腎功能的穩定對于移植腎受者的長期生存至關重要[7]。近期研究發現，CYP3A5*3的SNP對穩定期腎移植受者腎功能的影響尚存在爭議[8-9]。本研究以我國穩定期腎移植受者為對象，初步探討其CYP3A5*3（rs776746）基因多態性對TAC標準化血藥濃度（Dose adjusted blood concentration，C/D）及Scr水平的影響，分析CYP3A5*3基因多態性與穩定期腎移植受者TAC給藥方案和腎功能的相關性，以期為臨床個體化治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究方案經我院醫學倫理委員會審核通過后，選擇1995年3月1日-2014年12月31日在我院接受腎移植手術，且行長期門診隨訪的穩定期腎移植受者。

納入標準：（1）腎移植受者術后使用以TAC為基礎的三聯抗排斥方案；（2）腎移植術后時間超過12個月（穩定期）；（3）年齡>18歲；（4）肝功能正常；（5）未聯合使用CYP3A酶抑制劑或誘導劑。排除標準：（1）二次移植的腎移植受者；（2）使用環孢素的腎移植受者。

本研究共納入穩定期腎移植受者98例。其中，男性32例、女性66例，平均年齡（44.36±9.79）歲，平均體質量（63.95±10.78）kg，腎移植術后中位時間為49.50（28.75，98.25）個月。所有腎移植受者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 治療方法及隨訪

1.2.1 治療方法 所有腎移植受者術后均接受他克莫司+麥考酚鈉+醋酸潑尼松三聯抗排斥方案：他克莫司膠囊（商品名：普樂可復，愛爾蘭Astellas Pharma Co. Limited，注冊證號： H20084386，規格：0.5 mg）每日0.04～0.20 mg/kg，q12 h，于餐前1 h或餐后2～3 h口服；麥考酚鈉腸溶片（商品名：米芙，瑞士Novartis Pharma Schweiz AG，注冊證號：H20080647，規格：180 mg）每次0.18～0.72 g，q12 h，于餐后0.5 h口服；醋酸潑尼松片（上海上藥信誼藥廠有限公司，批準文號：國藥準字H31020675，規格：5 mg）每日2.5～10.0 mg，qd，于晨起餐后0.5 h口服。

1.2.2 隨訪 所有腎移植受者術后均至門診進行定期隨訪。隨訪期間，在治療藥物監測室檢測TAC血藥濃度的同時，由腎移植臨床藥師提供用藥教育和咨詢，并收集當天的TAC血藥濃度、肝功能（總膽紅素、直接膽紅素、白蛋白、球蛋白、丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、γ-谷氨酰基轉肽酶）及腎功能（Scr、尿素、血糖、血鉀）等資料。本研究納入所有腎移植受者2016年1月1日-12月31日的隨訪信息。

1.3 TAC血藥谷濃度的檢測及C/D值的計算

腎移植受者于門診隨訪當日早晨7：00-8：00（服藥前0.5 h）在門診檢驗科采集外周靜脈血1 mL，置于乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝管中，并于8：30前送至藥學部治療藥物監測室。按照TAC檢測試劑盒（美國Abbott公司）說明書對樣品進行預處理，預處理后的血漿樣品采用Architect i1000SR型全自動免疫分析儀（美國Abbott公司）和化學發光微粒子免疫分析（Chemiluminescence microparticle immuno assay，CMIA）法進行檢測[10]，計算其C/D值[（ng·kg）/（mL·mg），以測得的TAC血藥谷濃度（Concentration）除以經體質量校正的TAC日劑量（Dosage）]。

1.4 Scr水平的檢測

腎移植受者于門診隨訪當日早晨7：00-8：00（服藥前0.5 h）在門診檢驗科采集外周靜脈血1 mL，置于含分離膠、促凝劑的真空采血管中，按照Scr檢測試劑盒（美國強生公司）說明書方法操作，采用VITROS 350型全自動干化學分析儀（美國強生公司）和干化學法檢測其體內Scr水平。

1.5 CYP3A5*3基因分型的檢測

使用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（Polymerase chain reaction-restriction fragement length polymorphism，PCR-RFLP）法和直接測序法檢測各腎移植受者的CYP3A5*3基因分型[11]。

1.5.1 DNA的提取 將留取檢測TAC血藥谷濃度的剩余全血樣本置于EDTA-K2抗凝管中，于2～4 ℃冰箱中保存，8 h后轉移至-20 ℃冰箱中，冷凍；標本存放時間超過1個月后，再轉移至-80 ℃冰箱中。按血液標本DNA提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司）說明書提取DNA。

1.5.2 引物設計 根據CYP3A5*3（rs776746）基因的目標序列和所選擇的多態性位點，采用Sequenom Mass- ARRAY Assay Design 3.1軟件（美國Sequenom公司），由上海歐易生物有限公司設計、合成多重PCR特異性擴增引物和特異性延伸引物：5′ -ACTGCCCTTGCAGC- ATTTA-3′（正向）、5′ -CCAGGAAGCCAGACTTTGA-3′ （反向），引物長度為393 bp。

1.5.3 PCR反應體系和擴增條件 反應體系含DNA模板1 μL，10×rTaq Buffer 3 μL，50×dNTP mix 0.5 μL，正、反向引物各0.5 μL，Takara rTaq 0.4 μL，加入ddH2O至總體積達40 μL。在ABI 9700型PCR儀（美國ABI公司）上進行擴增，擴增條件為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃再延伸10 min，共35個循環[11]。

1.5.4 基因分型 使用ABI 3730XL型測序儀（美國ABI公司）和直接測序法進行序列測定，以確定各腎移植受者的CYP3A5*3基因分型[11]。

1.6 統計學方法

使用SHEsis在線分析軟件（http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）對CYP3A5*3等位基因和基因型頻率進行分析，并采用χ2檢驗進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗（當P>0.05時，表明各基因型頻率達到遺傳平衡）。

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。計量資料采用Shapiro-Wilk法進行正態性檢驗，采用Levene檢驗對正態分布的變量進行方差齊性檢驗。符合正態分布且方差齊的計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）或Student Newman Keuls（SNK）檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal Wallis H檢驗或Mann-Whitney U檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CYP3A5*3等位基因和基因型分布

98例腎移植受者中，CYP3A5*3 *1/*1（AA）、*1/*3（AG）、*3/*3（GG）型的頻率（例數）分別為9.18%（9例）、37.76%（37例）、53.06%（52例），等位基因*1（A）和*3（G）的頻率（例數）分別為28.06%（55例）和71.94%（141例）。CYP3A5*3各基因型頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（χ2=0.412，P=0.521）。

2.2 CYP3A5*3基因多態性對TAC的C/D值的影響

腎移植受者術后TAC治療1年以上的靶濃度應為4～8 ng/mL[4]。對于98例腎移植術后中位時間為49.50個月的穩定期腎移植受者而言，CYP3A5*3各基因型（*1/*1、*1/*3和*3/*3型）受者TAC血藥谷濃度比較，差異無統計學意義（P>0.05）；而各基因型受者TAC劑量和C/D值比較，差異均有統計學意義（P<0.05），詳見表1。

兩兩比較結果顯示，*3/*3型受者的TAC劑量顯著低于*1/*1和*1/*3型受者，且*1/*3型受者顯著低于*1/*1型受者；*3/*3型受者的TAC的C/D值顯著高于*1/*3、*1/*1型受者，且*1/*3型受者顯著高于*1/*1型受者，差異均有統計學意義（P<0.05），詳見圖1。

2.3 CYP3A5*3基因多態性對Scr水平的影響

對于腎移植術后中位時間為49.50個月的穩定期腎移植受者而言，CYP3A5*3各基因型（*1/*1、*1/*3和*3/*3）受者的Scr水平[依次為105.00（84.50，120.50）、108.00（83.00，130.50）、101.00（83.50，115.75）μmol/L]比較，差異無統計學意義（H=0.940，P=0.625）。

3 討論

TAC是腎移植受者免疫抑制劑聯合給藥方案中的基礎藥物，其合理使用對于移植腎的存活和腎移植受者的長期生存具有重要意義[12]。CYP3A5*3在我國腎移植受者中的突變頻率為50%～70%，是導致TAC藥動學個體差異的主要因素[4-5]。臨床研究與實踐證實，腎移植受者應根據CYP3A5*3基因型制訂TAC給藥方案，再依據TDM結果調整TAC給藥劑量[2，13]。

本文針對98例術后中位時間為49.50個月的穩定期腎移植受者進行了研究。結果發現，CYP3A5*3的基因突變（G等位基因）頻率為71.94%，和文獻[4-5]的結果基本一致，且各基因型達到遺傳平衡。Chen P等[4]對我國194例腎移植受者的研究表明，術后第6個月CYP3A5*3各基因型受者均達到了相同的TAC靶濃度，CYP3A5*3表達者比CYP3A5*3非表達者需要更高的TAC日劑量[0.107（0.089，0.139）mg/kg vs. 0.066（0.048，0.098）mg/kg，P<0.01]，但此研究并未探究術后12個月以上的情況。Cheng Y等[5]針對我國26例腎移植受者的研究表明，術后第6個月達到相同的TAC靶濃度時，CYP3A5*3表達者比CYP3A5*3非表達者需要更高的TAC日劑量（P<0.05）；術后第12個月時，CYP3A5*3各基因型受者TAC日劑量間的差異并無統計學意義[0.06（0.05，0.08）mg/kg vs. 0.07（0.06，0.08）mg/kg vs. 0.07（0.06，0.07）mg/kg，P>0.05]，但此研究納入的病例較少。本研究以我國腎移植術后時間超過12個月的98例穩定期腎移植受者作為研究對象，研究結果表明，CYP3A5*3 *1/*1、*1/*3、*3/*3型受者體內TAC均達到了相同的治療靶濃度（P>0.05），且*1/*3和*3/*3型受者的TAC的C/D值均顯著高于*1/*1型受者（P<0.05）。這提示穩定期腎移植受者若要達到相同的TAC靶濃度，攜帶CYP3A5*3等位基因（*1/*3和*3/*3型）的腎移植受者較*1/*1型受者所需的日劑量更低。本研究也證實了上述結果（見表1、圖1A）。CYP3A5*3基因型影響腎移植受者TAC代謝差異的分子機制與CYP3A5*3基因多態性影響其編碼蛋白表達和代謝酶活性的高低有關[14]：腎移植受者TAC代謝主要受CYP3A5酶的調控，而CYP3A5酶的活性主要受CYP3A5*3基因多態性的影響。CYP3A5*3（6986A>G）堿基突變可導致翻譯出無功能的CYP3A5蛋白，從而導致攜帶CYP3A5*3等位基因的穩定期腎移植受者體內CYP3A5酶的活性低于*1/*1型受者，進而導致該群體TAC的C/D值的個體差異。

然而，CYP3A5*3基因突變對穩定期腎移植受者腎功能的影響仍存在爭議[8-9]。目前，腎功能的評價指標包括Scr、肌酐清除率、腎小球濾過率和胱抑素C等；對于穩定期的腎移植受者，主要通過定期門診隨訪監測Scr水平進行評價[15]。Genvigir FD等[8]針對151例巴西腎移植受者的研究證實，CYP3A5*3基因多態性可影響腎移植術后第90天（術后第3個月）的估算腎小球濾過率（Estimated glomerular filtration rate，eGFR），但并未對CYP3A5*3基因多態性與術后3個月以上eGFR的相關性進行研究。Flahault A等[9]針對577例法國腎移植受者的最新研究證實，CYP3A5*3基因多態性并不影響其術后3個月、1年、2年、3年、4年和5年的eGFR。Pallet N等[16]針對236例法國腎移植受者的研究表明，CYP3A5*3基因多態性并不影響腎移植術后5年以上受者的Scr水平。本文對于我國98例穩定期腎移植受者的研究發現，CYP3A5*3基因多態性與受者的Scr水平并無相關性（P>0.05）。但本研究并未納入肌酐清除率、腎小球濾過率和胱抑素C等相關參數來綜合評價CYP3A5*3基因多態性與腎功能的相關性，故仍待后續研究予以完善。

綜上所述，CYP3A5*3基因多態性對我國穩定期腎移植受者TAC的血藥濃度有顯著性影響，*3等位基因攜帶者TAC的C/D值更高，且每日所需的劑量更低；但CYP3A5*3基因多態性可能與其Scr水平無關。由于本研究納入的樣本量較小，且腎功能評價指標較少，故尚無法明確CYP3A5*3基因多態性是否能影響我國穩定期腎移植受者的腎功能，仍有待擴大樣本量、納入更多的腎功能評價指標進一步確證。

參考文獻

[ 1 ] SCALEA JR，LEVI ST，ALLY W， et al. Tacrolimus for the prevention and treatment of rejection of solid organ transplants[J]. Expert Rev Clin Immunol，2016，12（3）：333- 342.

[ 2 ] 謝華，王榮，武曉玉， 等. 他克莫司血藥濃度監測與合理用藥分析[J]. 中國藥房， 2013， 24（26）： 2427-2429.

[ 3 ] ZALTZMAN AS， GLICK LA， ZALTZMAN JS， et al. The role of CYP3A5 polymorphism and dose adjustments following conversion of twice-daily to once-daily tacrolimus in renal transplant recipients[J]. Transplant Res， 2016. DOI： 10.1186/s13737-016-0031-6.

[ 4 ] CHEN P， LI J， LI J， et al. Dynamic effects of CYP3A5 polymorphism on dose requirement and trough concentration of tacrolimus in renal transplant recipients[J]. J Clin Pharm Ther， 2017， 42（1）：93-97.

[ 5 ] CHENG Y，LI H，MENG Y，et al. Effect of CYP3A5 polymorphism on the pharmacokinetics of tacrolimus and acute rejection in renal transplant recipients： experience at a single centre[J]. Int J Clin Pract Suppl， 2015. DOI： 10.1111/ijcp.12662.

[ 6 ] PAN P， HU BJ， LI M， et al. A meta-analysis on diagnostic value of serum cystatin C and creatinine for the evaluation of glomerular filtration function in renal transplant patients[J]. Afr Health Sci， 2014， 14（4）： 1025-1035.

[ 7 ] NETT PC， HEISEY DM， SHAMES BD， et al. Influence of kidney function to the impact of acute rejection on longterm kidney transplant survival[J]. Transplant Int，2005， 18（4）： 385-389.

[ 8 ] GENVIGIR FD， SALGADO PC， FELIPE CR， et al. Influence of the CYP3A4/5 genetic score and ABCB1 polymorphisms on tacrolimus exposure and renal function in Brazilian kidney transplant patients[J]. Pharmacogenet Genomics， 2016， 26（10）： 462-472.

[ 9 ] FLAHAULT A， ANGLICHEAU D， LORIOT MA， et al. Clinical impact of the CYP3A5 6986A>G allelic variant on kidney transplantation outcomes[J]. Pharmacogenomics， 2017， 18（2）： 165-173.

[10] BAZIN C， GUINEDOR A， BARAU C， et al. Evaluation of the Architect tacrolimus assay in kidney， liver， and heart transplant recipients[J]. J Pharm Biomed Anal， 2010， 53（4）：997-1002.

[11] 王學彬， 王卓， 高申， 等. CYP3A5和ABCB1多態性對腎移植受者由環孢素轉換為他克莫司個體化給藥的影響[J]. 第二軍醫大學學報， 2014， 35（12）： 1320-1326.

[12] 中華醫學會器官移植學分會， 中國醫師協會器官移植醫師分會. 中國腎移植受者免疫抑制治療指南：2016版[J]. 器官移植， 2016， 7（5）： 1-5.

[13] ZHU L， ZHANG J， SONG H， et al. Relationships of related genetic polymorphisms and individualized medication of tacrolimus in patients with renal transplantation[J]. Int J Clin Exp Med， 2015， 8（10）： 19006-19013.

[14] TANG HL， XIE HG， YAO Y， et al. Lower tacrolimus daily dose requirements and acute rejection rates in the CYP3A5 nonexpressers than expressers[J]. Pharmacogenet Genomics， 2011， 21（11）：713-720.

[15] 中華醫學會器官移植學分會， 中國醫師協會器官移植醫師分會. 中國腎移植排斥反應臨床診療指南：2016版[J]. 器官移植， 2016，7（5）： 6-12.

[16] PALLET N，ETIENNE I，BUCHLER M， et al. Long-term clinical impact of adaptation of initial tacrolimus dosing to CYP3A5 genotype[J]. Am J Transplant， 2016，16（9）： 2670-2675.

（收稿日期：2017-03-30 修回日期：2017-11-21）

（編輯：張元媛）