超臨界流體色譜技術在藥物分析領域的應用研究進展

張元　閆加慶　劉敏　周偉娥　吳文杰　劉佳　李國輝

中圖分類號 R275.9 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）02-0283-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.02.33

摘 要 目的：為更好地促進超臨界流體色譜（SFC）技術在藥物分析工作中的應用提供參考。方法：以“超臨界流體色譜”“SFC”“合相色譜”“UPC”“中藥”“Supercritical fluid chromatography”“UltraPerformance convergence chromatography”等為關鍵詞，組合查詢在中國知網、萬方數據庫、維普數據庫、Web of Science等數據庫中收錄的2012年1月-2017年6月發表的相關研究文獻，進行歸納和總結。結果與結論：共檢索到相關研究文獻315篇，其中有效文獻38篇。SFC技術實現分離主要原理是根據待測物在固定相和流動相兩相中的分配系數不同，繼而實現對待測物的先后洗脫。SFC技術在手性藥物分析領域的應用主要涉及化學藥手性成分拆分和中藥手性成分拆分兩個方面；在非手性藥物分析領域的應用主要涉及天然產物分離及制備、代謝組學研究、維生素分離及測定和指紋圖譜研究等方面。具有快速、高效、靈敏、環保等優點的SFC及其聯用技術給藥物成分的定性與定量分析提供了一條新的思路。

關鍵詞 超臨界流體色譜；藥物分析；手性藥物；非手性藥物；研究進展

超臨界流體色譜（Supercritical fluid chromatography，SFC）是指以超臨界流體為流動相的一種色譜類型。考慮到超臨界流體兼具液體的高密度和氣體的低黏度，在分析化學領域，其可作為氣相色譜（Gas chromatography，GC）和高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）的有力補充，應用于多種不同種類化合物的分離測定。

SFC最早于20世紀60年代被分析化學工作者提出[1]。經過近20年的緩慢發展，空心毛細管柱式SFC于20世紀80年代早期被成功開發[1]，其出現加速了SFC技術的發展。隨后，新型填充柱式SFC也應運而生，進一步加速了SFC技術在應用領域的發展。至21世紀初期，許多針對SFC技術在不同領域應用的研究文章相繼發表[2-3]。2012年3月，美國Waters公司推出了新型商品化的超臨界流體色譜系統——超高效合相色譜（UltraPerformance convergence chromatography，UPC2）系統，同時，基于亞2 μm粒徑填料的色譜柱也被開發出來[4]。自此，SFC技術的應用得到飛速發展，且在實踐中成功與蒸發光散射檢測器、紅外檢測器、熒光檢測器等多種檢測器聯用[5-6]。其中，SFC與質譜（MS）聯用具有靈敏度高、綠色環保等優勢，在分析化學領域引起了極大的關注[7-8]。目前，SFC技術已被廣泛應用于各個領域，如食品安全領域、環境分析領域、臨床及生物樣本分析領域[9-10]，而在藥品及制劑質量控制與分析領域亦得到了廣泛的應用，為推動該領域的技術進步作出了貢獻[11-12]。本研究中，筆者以“超臨界流體色譜”“SFC”“合相色譜”“UPC”“中藥”“Supercritical fluid chromatography”“UltraPerformance convergence chromatography”等為關鍵詞，組合查詢在中國知網、萬方數據庫、維普數據庫、Web of Science等數據庫中收錄的2012年1月-2017年6月發表的相關研究文獻（共檢索到相關研究文獻315篇，其中有效文獻38篇），進行歸納和總結，以期為更好地促進SFC技術在藥物分析工作中的應用提供參考。

1 SFC基本原理及特點

SFC對待測物實現分離主要原理是根據待測物在固定相和流動相兩相中的分配系數不同，繼而實現對待測物的先后洗脫。早期SFC系統由于設備很難控制超臨界流體壓力，常導致色譜分離性能不穩定，限制了該技術的推廣和應用[13]。近些年來，隨著流體傳輸設計、溫度和壓力控制等技術的創新，SFC系統壓力得以精準控制，加之超臨界流體具有擴散和傳質速率快、黏度低的特點，可彌補GC和HPLC系統在分析功能上的不足。

不同于傳統的GC和HPLC，SFC流動相是一種介于氣體和液體之間的超臨界流體[13]，兼有液體的高密度和氣體的低黏度優勢。很多物質均已被證明能夠達到超臨界流體狀態，目前，已有超過1 000種物質被確定了超臨界參數，常見的包括CO2、CCl2F2、N2O等[14]。由于SFC中流動相的使用量很小，早期很多物質均被采用作為SFC的流動相，甚至一些有毒、貴重的流體。但隨著新型設備被成功開發，絕大多數流體現已很少采用，而考慮到CO2無毒無害、易于獲得且達到超臨界所需溫度和壓力條件較容易實現，目前絕大多數情況下均采用其作為SFC的流動相。既往SFC多用于非極性或弱極性物質的測定，主要考慮到超臨界CO2流體的極性較低。近年來通過將甲醇等極性試劑加入CO2中，以增加超臨界流動相的極性，從而增加了SFC對極性物質的溶解和洗脫能力，使其應用范圍大大擴展。

同時，填充柱的出現也很大程度推動了SFC的發展。相比HPLC流動相為液體，SFC所用超臨界流體具有高擴散性和低黏性的優勢，因此分離速度顯著加快；并且，與液體流動相密度受溫度和壓力影響較小不同，超臨界流體密度隨溫度和壓力的變化會出現較大的變化，導致流動相的溶劑化能力出現較大程度的變化。鑒于此，除了可通過改變流動相種類以及調整添加劑的使用量對待測化合物的保留情況進行調節以外，還可以通過調整溫度、壓力（通過控制系統內背壓實現）等影響流動相密度的因素較輕松地對待測化合物的保留情況進行調節。

2 SFC技術在手性藥物分析領域的應用

手性物質在自然界中廣泛存在[15]，目前臨床使用的藥物中約有50%為手性藥物。關于手性對藥物藥效的影響目前已有較多研究，手性藥物中一對對映異構體不僅在臨床療效方面有較大差異，而且會導致嚴重程度不一的不良反應，部分手性異構體不良反應甚至完全不同[16]。與此同時，在進行藥動學研究時，手性藥物在體內的藥動學參數可呈現完全不同的特點。鑒于此，對手性藥物進行拆分測定，不僅對藥物的質量評定、治療效果和不良反應預測有重要意義，而且對于新藥開發也能發揮重要的作用[17]。

目前，SFC技術在手性藥物拆分方面已取得了較大進展，在化學藥對映異構體拆分、天然產物手性分析以及藥物代謝組學研究和藥物指紋圖譜研究等方面，均獲得了較廣泛的應用。在手性藥物拆分時，SFC流動相主要采用CO2，而固定相則種類較多，早期其手性固定相填料主要參考GC和HPLC手性固定相，此后一些新型的手性固定相則相繼問世。據報道，目前使用的SFC手性固定相已逾1 000種，常見的有多聚糖衍生物類手性固定相、環糊精類手性固定相、大環內酯類抗生素類手性固定相、Pirkle型手性固定相等[12]。

2.1 SFC技術在化學藥手性成分拆分中的應用

既往在進行化學藥手性成分拆分的時候較多考慮傳統HPLC方法，但隨著SFC技術發展，研究者發現相較傳統HPLC方法，SFC方法在分離手性藥物的時候具有很大優勢：對于部分手性藥物SFC不僅分離效能比HPLC更高，而且能顯著縮短分離時間。因此，目前很多研究者在進行手性藥物拆分時均會首先考慮進行SFC方法的嘗試。

戴濤等[18]采用SFC技術實現了對齊留通對映異構體的有效分離，試驗中對比了5款不同類型色譜柱，最終選定Chiral-pak? AD H色譜柱作為分離柱；同時在該柱上考察了改性劑的種類、濃度、溫度及背壓等不同因素對分離效果的影響，最終選定改性劑為18%異丙醇，背壓為140 bar（1 bar=100 kPa），溫度為303 K。在該條件下，可實現對齊留通對映異構體最佳分離，分離度高達11.5。金薇等[19]建立了拆分左乙拉西坦及其右旋異構體的SFC方法，分別考察了改性劑、背壓、柱溫和流速等因素對分離效果的影響，采用Chiralcel OD色譜柱，12%無水乙醇的CO2為改性劑，流速為2.0 mL/min，背壓為15 MPa，柱溫為40 ℃，使待測化合物得到最好的分離。金薇等[20]還建立了對依折麥布及其R-對映體的SFC手性拆分方法，同樣采用Chiralcel OD色譜柱，以超臨界CO2 -含0.1%三氟乙酸的0.1%三乙胺的甲醇（90 ∶ 10，V/V）為流動相，背壓為15 MPa，柱溫為35 ℃，流速為3.0 mL/min分離依折麥布及其R-對映體，取得了較好的拆分效果。羅英豪[21]采用SFC方法對萘普生對映體進行拆分，以萘普生對映體的分離時間、容量因子、分離度為考察指標，優選手性色譜柱、流動相中極性添加劑種類及占比、背壓和柱溫等條件，最終選用Chiralpak? AD-H手性色譜柱，20%異丙醇為改性劑，背壓170 bar，柱溫20 ℃。在此條件下萘普生對映體分離度高達4.31，分離因子為1.90，且精密度、穩定性和重復性等相關指標均滿足檢測需求。楊杰鋒等[22]采用SFC方法分離和測定了碘帕醇的對映異構體的含量，選用Chiralpak? OD-H手性色譜柱，以CO2-甲醇（89 ∶ 11，V/V）為流動相，結果R-碘帕醇與S-碘帕醇分離度良好，該法對R-碘帕醇質量濃度在0.2～1.2 mg/mL范圍內線性關系良好，精密度、回收率等方法學參數均滿足檢測需求。研究者還對比了現行R-碘帕醇含量限制的標準，提出可考慮將直接定量方法引入對R-碘帕醇含量的控制。

SFC方法相比HPLC方法在拆分手性異構體時具有較多優勢，不僅對單對手性化合物分離效能高、分析時間短，對于多對手性化合物的同時分離也能取得較為滿意的效果。庾莉菊等[23]建立了同時測定鹽酸蘭地洛爾中立體異構體含量的SFC方法。鹽酸蘭地洛爾具有2個手性中心，除臨床常用的S，S-異構體外，還有3個立體異構體。該法選用Chiralpak? IF手性色譜柱，以CO2為流動相，甲醇-正丁醇-乙腈（1 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）+0.5%氨水為助溶劑，梯度洗脫。在該色譜條件下，鹽酸蘭地洛爾的R，R-異構體、R，S-異構體和S，R-異構體可以達到基線分離，方法檢測限分別為0.3、0.4和0.3 mg/L，能滿足鹽酸蘭地洛爾樣品中3個立體異構體檢測的相關要求。李冬艷等[24]采用6種多糖類手性固定相實現了對11種手性化合物的分離，試驗以鍵合型多糖系列柱i-chiral 6：ChiralpakIA、IB、IC、ID、IE、IF分別為手性固定相，在SFC模式下對11種手性化合物進行手性分離，同時探討了改性劑種類、濃度、堿性添加劑以及特殊改性劑對手性分離的影響。結果，6種手性柱對11種化合物的識別能力如下：IA可以識別其中的10個，IB可以識別5個，IC可以識別7個，ID可以識別9個，IE可以識別8個，IF可以識別8個。試驗結果表明i-chiral 6系列手性柱手性識別能力具有一定的互補性，對不同手性化合物的分離提供了更多的選擇。Huang J等[25]應用多糖手性固定相成功分離了6對苯基哌嗪衍生物對映異構體，色譜柱選用Chiralpak? IA CSP柱，改性劑選用異丙醇，優化了柱溫、背壓等條件后，6對化合物均能在10 min內達到基線分離。

2.2 SFC技術在中藥手性成分拆分中的應用

臨床常用的中藥中很多成分都存在手性異構體，但既往中藥中手性成分拆分及相關研究并未得到足夠重視。考慮原因可能與中藥本身成分復雜，在進行藥物分離時已然面對著較大困難，若進一步進行手性成分拆分難度更大；與此同時，手性藥物拆分技術的不足也桎梏著中藥手性成分分離的發展。伴隨著對中藥手性成分認識的提高和手性成分拆分技術的進步，目前中藥手性成分拆分研究方面已取得了較大發展。

劉佩等[26]建立了一種新型丹參素異丙酯和冰片酯的合成途徑并采用SFC方法對兩者的對映異構體進行了拆分研究。所得混旋丹參素異丙酯的手性拆分SFC分離條件為：Chiralpak? AD-H手性柱，乙醇-水（40 ∶ 60，V/V）為改性劑，溫度為35 ℃，流速為125 mL/min。在該條件下混旋丹參素異丙酯拆分后收率高達93%，10 g混旋物約可得到4.8 g S-丹參素異丙酯（光學純度為99.6%）和4.5 g R-丹參素異丙酯（光學純度為99.5%）。所得混旋丹參素冰片酯的手性拆分SFC分離條件為：Chiralpak? AD-H手性柱，乙醇-水（20 ∶ 80，V/V）為改性劑，溫度為35 ℃，流速為130 mL/min。在該條件下混旋丹參素冰片酯拆分后收率達90%，15 g混旋物分別得到6.9 g S-丹參素冰片酯（光學純度為99.5%）和6.6 g R-丹參素冰片酯（光學純度為99.5%）。陳海等[27]采用新型SFC成功拆分了反式-二苯乙烯氧化物（TSO）、安息香手性物質，兩種手性異構體分離度均達到3以上，實現了較好的分離。試驗中考察了不同因素對化合物分離效果的影響，結果表明，有機改性劑種類及濃度對分離效果均有影響，洗脫能力隨著改性劑濃度的增大而增大，分離度隨著改性劑濃度的增大而增大。

3 SFC技術在非手性藥物分析領域的應用

對于少數非手性藥物的分離和定量，目前傳統的GC或者HPLC方法還存在較多困難，如分離效能偏低、靈敏度不高、有機試劑消耗量大等，而采用SFC方法可有效提高分離效能和靈敏度，減小有機試劑消耗量。而對于大多數非手性藥物而言采用GC或者HPLC方法即可進行分離和分析，但相比較采用SFC方法可大大縮短分離時間；同時SFC方法所用改性劑為CO2，更為綠色環保，符合分析科學發展的理念。

3.1 SFC技術在天然產物分離及制備中的應用

近年來，伴隨著天然產物功能性成分的市場需求量逐年提升，對于天然產物中活性成分和有效成分的研究越來越多[28]。因此天然產物中相關成分分離及制備技術取得了較大進展，尤其是隨著SFC技術的飛速發展，制備型和半制備型SFC技術也應運而生，并在天然產物相關成分分離及制備中得到了較廣泛的應用[29]。

莫緒飛等[30]將SFC技術用于Z-藁本內酯的制備純化，采用ZorBax SB-C18色譜柱，分別優化了改性劑、流速、壓力、溫度等，從而確定了最適宜的色譜提純條件：CO2流速為10 g/min，柱溫為313.15 K，背壓為14 MPa。在此工藝條件下提純制備Z-藁本內酯單體，得到的產品純度為98.5%。朱玲玲等[31]對SFC技術在天然產物分離分析中的應用進展進行了綜述，指出該技術在維生素類、脂肪酸和甘油酯類、生物堿類、黃酮類、苯丙素類、萜類化合物等天然產物分離方面均具有很大的優勢，同時還能低成本、高效率地獲得高純度的單一化合物，大大提高了工作效率。徐永威等[32]綜述了UPC2技術在中藥研究和質量控制中的應用，指出UPC2技術在分析揮發性成分、熱敏性成分和天然動植物油等方面可作為GC技術的有效互補技術，在分析天然產物中大極性產物、小極性產物及手性異構體方面可以與HPLC技術有效互補；且此技術利用選擇性的差異改善了現有HPLC分析方法。同時該綜述還指出，UPC2技術可以與HPLC技術結合，構建2D或3D分析分離平臺，從而使分離效能進一步提高。

不僅制備型SFC技術在天然產物分析中取得了較大的應用進展，分析型SFC技術在天然產物分離中的應用也得到了較廣泛的關注。鄧亮等[33]建立了同時測定厚樸中厚樸酚及和厚樸酚成分的SFC方法，厚樸樣品經微波提取后直接上機檢測，選用Kramasil色譜柱，甲醇為改性劑，背壓為200 bar，柱溫為50 ℃。在此條件下，該法的檢測限達到3～4 μg/mL，且對目標化合物分離良好，滿足測定需求。李振宇等[34]建立了一種對吳茱萸中吲哚類生物堿的SFC快速分析方法，并比較了不同色譜柱、進樣體積、改性劑、添加劑、溫度和背壓對保留行為的影響，指出了進樣體積對峰形影響顯著，降低溫度和升高背壓會使保留時間減小；優化后采用UPC2 BEH色譜柱，甲醇為改性劑，柱溫為35 ℃，背壓為2.07×107 Pa。在該條件下，全部化合物在15 min內完成分離，滿足快速檢測的需求。王波等[35]基于SFC方法快速測定了黃芪中5種黃酮類化合物，選用UPC2 CSH 柱，甲醇溶液（含0.2% H3PO4）為改性劑，柱溫為40 ℃，僅需15 min即可實現5種黃酮類化合物的基線分離，相比傳統的HPLC方法，分析速度提高3倍以上。王波等[36]還采用UPC2系統快速測定了中成藥及原料藥中的香豆素，樣品經溶劑誘導相變萃取后上機檢測，在選定色譜條件下，分析時間僅為常規超高效液相色譜（UPLC）系統所需分析時間的1/4，同時檢出限、定量限均滿足檢測需求。

3.2 SFC技術在代謝組學研究中的應用

代謝組學是以組群指標分析為基礎，以高通量檢測和數據處理為手段，以信息建模與系統整合為目標的系統生物學的一個分支，在臨床醫學領域具有較廣闊的應用前景。既往在進行代謝組學研究時，較多采用HPLC或HPLC-MS技術，但隨著SFC技術的發展，其應用于代謝組學的研究也逐漸被報道，且其譜圖一定程度上能與HPLC譜圖形成互補，共同促進一些新生物標志物的發現。

張淑麗等[37]利用UPC2-Q/TOF-MS技術對果糖誘導高尿酸血癥大鼠血清脂質代謝組學進行了研究，分別通過該技術分析高尿酸血癥大鼠和正常大鼠血清代謝譜圖，采用多元統計分析方法比較兩組的代謝譜圖差異，從而篩選出差異性代謝物。結果顯示，兩組大鼠代謝譜圖存在明顯差異，并篩選出11個差異代謝物，利用精確質量數結合二級質譜圖初步確定了花生四烯酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸等8種潛在生物標記物。朱健等[38]利用UPC2方法研究了異甜菊醇鈉在大鼠小腸各腸段的吸收特征，試驗建立的方法所用分析時間為7 min，可顯著節省時間成本，同時專屬性較高，靈敏度滿足檢測需求。

3.3 SFC技術在維生素分離及測定中的應用

近年來，采用SFC技術對維生素類化合物進行測定的方法報道較多，SFC方法相較于傳統HPLC方法具有分離時間短、分離效能高等優勢。竹弘等[39]建立了同時測定復合維生素片中4種不同水溶性維生素的SFC方法，樣品經碾碎、超聲提取后上機檢測，并對4種不同色譜柱、不同提取溶劑及改性劑的種類和濃度等影響因素進行了考察，最終選擇Kromasil 60-5 CN色譜柱，0.1%甲醇為改性劑，實現了對4種水溶性維生素的良好分離及測定。該方法簡便、準確、靈敏度高，較好地滿足了檢測需求。張春蘭等[40]則建立了測定維生素復方制劑中3種水溶性維生素的SFC方法，選用Cyano填充柱，以含有少量二乙胺的甲醇為改性劑。優化后的SFC方法不僅分離效能高，而且分析速度快，樣品分析在5 min內即可完成，專屬性、重復性和線性關系較好，檢測靈敏度滿足需求。周圍等[41]亦建立了同時測定11種脂溶性維生素及衍生物的UPC2方法，最終選擇Waters Acquity UPC2 HSS C18 SB為色譜柱，乙腈作為助溶劑，動態背壓為1 900 psi（1 psi=6.895 kPa），柱溫為50 ℃。所建立方法的檢測限在1.5～2.0 mg/L之間，線性范圍分別為3～300 mg/L，加樣回收率范圍為97.31%～98.76%，可以滿足復雜基質中11種脂溶性維生素及其衍生物的檢測要求。劉倩倩等[42]采用SFC方法直接測定橘子、鮮棗、干棗及飲料中的維生素C含量，分別對色譜柱等因素進行考察優化，最終選定Waters CSH Fluoro-Phenyl（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）為色譜柱，含有0.05% H3PO4的甲醇為改性劑，方法檢測限達到1.5 mg/kg。該法具有高效、檢測速度快、靈敏度高、重復性好、試驗成本低等優點。

3.4 SFC技術在指紋圖譜研究中的應用

SFC技術因其不同于GC和HPLC技術分離機制的原因，亦可應用于藥物指紋圖譜研究領域，并與GC和HPLC圖譜形成互補，對更多有效成分進行發掘。朱瑞娟等[43]采用SFC方法建立了補腎健腦顆粒及其組成藥材的指紋圖譜，歸屬分析了補腎健腦顆粒指紋圖譜中的主要色譜峰，并建立β-蛻皮甾酮和松果菊苷的含量測定方法。該方法能將β-蛻皮甾酮和松果菊苷有效分離，與HPLC和UPLC方法相比，更簡便、快速，且分離度高、重復性好。

4 結語

通過對SFC技術在手性和非手性藥物分析中的應用進行歸納和總結，可以發現SFC因其獨有的以下優勢在藥物分析中將會占據越來越重要的地位：（1）SFC技術對于手性成分的分析相較于HPLC-MS技術等具有較大優勢，故在進行手性化合物拆分時可考慮作為首選；（2）SFC技術環保、綠色，且分離效能高，對于部分藥物分離時間顯著縮短，可作為GC和HPLC技術的有效補充應用于更多藥物的常規分離分析；（3）伴隨著UPC2系統的開發成功，SFC技術在藥物分析領域的應用范圍顯著拓展，且隨著SFC技術和質譜技術的飛速發展，今后SFC-MS聯用技術在藥物分析領域必將取得更大的研究進展。然而，SFC技術在藥物分析中仍有不足，如對于強極性化合物的洗脫仍不理想，相關色譜方法開發仍較少，不能完全滿足各種檢測需求。

綜上所述，隨著SFC技術的發展，越來越多的學者專家已認可SFC技術在手性藥物拆分和高通量藥物分離分析中的價值，快速、高效、靈敏、環保的SFC及其聯用技術給藥物成分的定性與定量分析提供了一條新的思路。相信隨著SFC技術難題一個個的被攻克，將會有越來越多的關于利用SFC技術進行藥物分離分析的研究被發表。

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（收稿日期：2017-07-17 修回日期：2017-12-11）

（編輯：周 箐）