UPLC—MS/MS法同時測定人血漿中卡馬西平、文拉法辛、羅格列酮和硝苯地平的濃度

王偉　丁仁奎　李清艷　祁妍敏

中圖分類號 R969.1；R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）02-0194-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.02.13

摘 要 目的：建立同時測定人血漿中卡馬西平、文拉法辛、羅格列酮和硝苯地平濃度的方法。方法：血漿樣品經甲醇（含0.1%甲酸）沉淀蛋白后，以鹽酸吡格列酮為內標，采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS C18，流動相為含0.01%甲酸的水溶液-含0.01%甲酸的甲醇溶液（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，柱溫為50 ℃，進樣量為5 μL；采用電噴霧離子源，以多反應監(jiān)測模式進行正離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 237.00→194.05（卡馬西平）、m/z 278.20→58.10（文拉法辛）、m/z 358.08→135.04（羅格列酮）、m/z 347.15→315.17（硝苯地平）、m/z 357.09→134.06（內標）。結果：卡馬西平、鹽酸文拉法辛、鹽酸羅格列酮、硝苯地平血藥濃度的線性范圍分別為2.00～2 000.00、2.12～2 120.00、2.00～2 000.00、2.04～1 020.00 ng/mL（r分別為0.995 9、0.990 5、0.991 5、0.991 0，n=5），最低檢測限分別為0.200、0.106、0.100、1.020 ng/mL；日內、日間RSD均小于15%，相對誤差的絕對值小于15%；提取回收率為65.66%～96.36%（RSD<15%，n=5），基質效應為80.99%～114.33%。采用該法測得2例癲癇患者體內卡馬西平的血藥濃度分別為（1 500.41±169.11）、（1 159.01±59.24）ng/mL（RSD分別為11.27%、5.60%，n=3），2例高血壓患者體內硝苯地平的血藥濃度分別為（14.68±1.92）、（21.18±3.59）ng/mL（RSD分別為16.98%、13.10%，n=3）。結論：該方法操作簡便，專屬性強，靈敏度、準確度高，可用于上述藥物的血藥濃度監(jiān)測及藥動學研究。

關鍵詞 卡馬西平；文拉法辛；羅格列酮；硝苯地平；血藥濃度；超高效液相色譜-串聯質譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To develop a method for simultaneous determination of carbamazepine， venlafaxine， rosiglitazone and nifedipine in human plasma. METHODS： UPLC-MS/MS method was adopted to determine plasma sample after precipitated with methanol （containing 0.1% formic acid） using pioglitazone hydrochloride as internal standard. The determination was performed on Waters ACQUITY UPLC HSS C18 column with mobile phase consisted of aqueous solution containing 0.01% formic acid-methanol containing 0.01% formic acid （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 50 ℃， and sample size was 5 μL. ESI was used for positive ion scanning by multi reaction monitoring mode. The ion pairs for quantitative analysis were m/z 237.00 to 194.05 （carbamazepine）， m/z 278.20 to 58.10 （venlafaxine）， m/z 358.08 to 135.04 （rosiglitazone）， m/z 347.15 to 315.17 （nifedipine）， m/z 357.09 to 134.06 （internal standard）. RESULTS： The liner ranges of carbamazepine， venlafaxine hydrochloride， rosiglitazone hydrochloride and nifedipine were 2.00-2 000.00 （r=0.995 9，n=5）， 2.12-2 120.00（r=0.990 5， n=5）， 2.00-2 000.00（r=0.991 5， n=5） and 2.04-1 020.00（r=0.991 0，n=5） ng/mL； the minimum detection limits were 0.200， 0.106， 0.100， 1.020 ng/mL， respectively. RSDs of inter-day and intra-day were less than 15%. The absolute values of RE were less than 15%. The extraction recoveries were 65.66%-96.36%（RSD%<15%，n=5）， and matrix effects ranged 80.99%-114.33%. The plasma concentrations of carbamazepine in 2 epileptic patients were （1 500.41±169.11）， （1 159.01±59.24） ng/mL（RSD were 11.27%， 5.60%，n=3）. The plasma concentrations of nifedipine in 2 hypertensive patients were （14.68±1.92），（21.18±3.59）ng/mL（RSD were 16.98%， 13.10%，n=3）. CONCLUSIONS： The method is simple， specific， sensitive， accurate and suitable for the monitoring of plasma concentration and pharmacodynamic study of above drugs.

KEYWORDS Carbamazepine； Venlafaxine； Rosiglitazone； Nifedipine； Plasma concentration； UPLC-MS/MS

卡馬西平是治療簡單部分性和復雜部分性癲癇的首選藥物，但其安全范圍小、有效劑量個體差異大，易引起不良反應（多與其環(huán)氧化物有關），如骨髓抑制、剝脫性皮炎等[1]。文拉法辛是新一代的抗抑郁首選藥，對各種類型抑郁癥（包括伴有焦慮的抑郁癥）及廣泛性焦慮癥均具有顯著療效，其不良反應包括胃腸道反應、癔病發(fā)作、出血等[2]。羅格列酮屬于噻唑烷二酮類抗糖尿病藥，被廣泛用于高血糖、高血壓等疾病的治療，但易引起心血管危險事件、貧血、低血糖等不良反應[3]。硝苯地平屬于二氫吡啶類鈣離子拮抗藥，在臨床上主要用于治療高血壓、心絞痛和心律失常等，不良反應包括頭痛、頭暈、體位性低血壓、心動過速等[4]。上述4種藥物均為臨床的首選或常用藥物，由于患者的個體差異或者長期用藥等因素可能導致不良反應的發(fā)生，而個別不良反應（如癔病發(fā)作、低血糖、低血壓、頭暈、頭痛等）容易影響駕駛者（地面和航空）的操作能力，存在引發(fā)重大安全事故的隱患[2-4]。目前有不少研究發(fā)現，一些中藥制劑和保健品普遍存在違規(guī)添加抗癲癇藥、抗糖尿病藥、抗高血壓藥、抗抑郁藥等現象，檢出的藥物包括卡馬西平、羅格列酮、硝苯地平等[5-7]。因此，為了建立快速、靈敏、準確測定人血漿中上述各類藥物濃度的方法，本研究在已有文獻的基礎上，首次建立了同時測定人血漿中卡馬西平、文拉法辛、羅格列酮和硝苯地平濃度的超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS），可用于臨床患者血藥濃度監(jiān)測及藥動學研究，也可為藥物相關駕駛安全事故的調查提供技術支持。

1 材料

1.1 儀器

AcquityTM UPLC型超高效液相色譜儀（配有二元梯度洗脫泵、自動進樣器和在線脫氣機）、AcquityTM TQ- MS型質譜儀（配有三重四極桿質量分析器）和Masslynx 4.1分析軟件（美國Waters公司）；BT25S型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；SIGMA 3-18K型臺式高速冷凍離心機（德國希格瑪公司）；Milli-Q Advantage A10型純水儀（美國密理博公司）；VORTEX-5型旋渦混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

卡馬西平對照品溶液（美國Sigma-Aldrich公司，批號：FN03241402，濃度：1 mg/mL）；鹽酸文拉法辛對照品（批號：100543-200401，純度：99.9%）、鹽酸羅格列酮對照品（批號：100673-200401，純度：91.3%）、硝苯地平對照品（批號：100338-201404，純度：99.9%）和鹽酸吡格列酮對照品（內標，批號：100634-201202，純度：100%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇、甲酸為色譜純，水為去離子水。

1.3 空白血漿

招募6例健康志愿者，于晨起空腹抽取其靜脈血，置于含肝素鈉抗凝劑的離心管中，以2 292×g離心5 min，取上清液置于-20 ℃冰箱中冷凍保存，備用。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：含0.01%甲酸的水溶液（A）-含0.01%甲酸的甲醇溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，85%A→30%A；2～6 min，30%A→5%A；6～7 min，5%A；7～7.1 min，5%A→85%A；7.1～10 min，85%A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：50 ℃；進樣量：5 μL。

2.1.2 質譜條件 電噴霧離子源；離子源溫度：120 ℃；去溶劑化溫度：350 ℃；液氮氣體流速：650 L/h；毛細管電壓：3.0 kV；采用多反應監(jiān)測（MRM）模式掃描，正離子方式檢測。4個待測物和內標的質譜參數見表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液及混合標準工作液 精密稱取鹽酸文拉法辛、鹽酸羅格列酮和硝苯地平對照品各適量，置于5 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成鹽酸文拉法辛、鹽酸羅格列酮、硝苯地平質量濃度分別為0.212、0.200、0.204 mg/mL的對照品貯備液。精密量取上述各貯備液和卡馬西平對照品溶液各適量，置于同一量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得鹽酸文拉法辛、鹽酸羅格列酮、硝苯地平、卡馬西平質量濃度分別為42.40、40.00、40.80、40.00 μg/mL的混合對照品溶液；隨后用甲醇稀釋，分別得鹽酸文拉法辛質量濃度為21.20、10.60、2.12、1.06、0.424、0.212、0.042 4 μg/mL，鹽酸羅格列酮質量濃度為20.00、10.00、2.00、1.00、0.40、0.20、0.04 μg/mL，硝苯地平質量濃度為20.40、10.20、2.04、1.02、0.408、0.204、0.040 8 μg/mL，卡馬西平質量濃度為20.00、10.00、2.00、1.00、0.40、0.20、0.04 μg/mL的系列混合標準工作液。

2.2.2 內標溶液 精密稱取內標對照品1.02 mg，置于5 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得質量濃度為0.204 mg/mL的內標貯備液。精密吸取上述貯備液25 μL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，得質量濃度為0.51 μg/mL的內標溶液。

2.3 血漿樣品的處理

精密量取空白血漿200 μL，置于1.5 mL塑料離心管中，加入內標溶液（0.51 μg/mL）5.0 μL，渦旋混勻30 s，加入甲醇（含0.1%甲酸）500 μL，渦旋混勻60 s，于4 ℃下、以15 493×g離心10 min，取上清液5 μL，進樣分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 分別取6個不同來源的人空白血漿各200 μL，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，得色譜圖1A；另配制4種待測物的血漿樣品（卡馬西平、鹽酸文拉法辛、鹽酸羅格列酮、硝苯地平的質量濃度分別為50.00、53.00、50.00、51.00 ng/mL），按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，得色譜圖1B；取臨床患者（服用卡馬西平或硝苯地平）的血漿樣品各適量，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，得色譜圖1C、圖1D。結果顯示，在“2.1”項色譜與質譜條件下，卡馬西平、文拉法辛、羅格列酮、硝苯地平和內標的分離度較好，保留時間分別為3.58、2.81、2.52、3.81、3.32 min；血漿中內源性物質不干擾上述待測物的測定。

2.4.2 標準曲線的繪制、定量下限及最低檢測限的考察 取空白血漿200 μL，精密加入“2.2.1”項下系列混合標準工作液各適量，配制成卡馬西平、鹽酸羅格列酮質量濃度均為2 000.00、1 000.00、500.00、100.00、50.00、20.00、10.00、2.00 ng/mL，鹽酸文拉法辛質量濃度為2 120.00、1 060.00、530.00、106.00、53.00、21.20、10.60、2.12 ng/mL，硝苯地平質量濃度為1 020.00、510.00、102.00、51.00、20.40、10.20、2.04 ng/mL的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，記錄色譜圖。以待測物質量濃度（x）為橫坐標、待測物與內標峰面積的比值（y）為縱坐標，進行加權（w=1/x）線性回歸。結果顯示，卡馬西平、鹽酸文拉法辛、鹽酸羅格列酮、硝苯地平血藥濃度的線性范圍分別為2.00～2 000.00、2.12～2 120.00、2.00～2 000.00、2.04～1 020.00 ng/mL（r分別為0.995 9、0.990 5、0.991 5、0.991 0，n=5），最低檢測限分別為0.200、0.106、0.100、1.020 ng/mL，詳見表2。

2.4.3 精密度、準確度和提取回收率試驗 取空白血漿200 μL，分別配制卡馬西平低、中、高質量濃度（5.00、80.00、1 200.00 ng/mL），鹽酸文拉法辛低、中、高質量濃度（5.30、84.80、1 272.00 ng/mL），鹽酸羅格列酮低、中、高質量濃度（5.00、80.00、1 200.00 ng/mL），硝苯地平低、中、高質量濃度（5.10、81.60、612.00 ng/mL）的質控樣品，各質量濃度平行配制5份，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，考察日內精密度；連續(xù)測定3 d，按當日標準曲線計算樣品的實測質量濃度，考察日間精密度。將實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，以相對誤差（RE）來考察準確度。將質控樣品的峰面積與空白血漿經提取后加入系列混合標準工作液進樣所得的峰面積進行比較，考察提取回收率。結果顯示，各質控樣品日內、日間RSD<15%，RE絕對值<15%；各待測物的提取回收率為65.66%～96.36%（RSD<15%，n=5）；內標的提取回收率為（94.64±4.73）%（RSD=5.01%，n=5），符合生物樣品定量分析方法驗證指導原則[8]，詳見表3。

2.4.4 基質效應 取空白血漿適量，按“2.3”項下方法處理后，加入“2.2”項下混合對照品溶液和內標溶液各適量，配制成卡馬西平低、中、高質量濃度（5.00、80.00、1 200.00 ng/mL），鹽酸文拉法辛低、中、高質量濃度（5.30、84.80、1 272.00 ng/mL），鹽酸羅格列酮低、中、高質量濃度（5.00、80.00、1 200.00 ng/mL），硝苯地平低、中、高質量濃度（5.10、81.60、612.00 ng/mL）的血漿樣品，進樣分析，記錄峰面積（A）；以空白溶劑[甲醇-水（5 ∶ 2，V/V）]配制相應質量濃度的標準溶液，進樣分析，記錄峰面積（B）；基質效應（%）=A/B×100%。每質量濃度平行配制5份。結果顯示，卡馬西平、鹽酸文拉法辛、鹽酸羅格列酮、硝苯地平的基質效應分別為84.15%～104.01%、80.99%～111.65%、81.66%～114.33%、81.86%～108.37%（RSD<15%，n=5）；內標的基質效應為（87.92±4.77）%（RSD=5.43%，n=5），提示基質效應不影響待測物的測定[8]。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 配制卡馬西平低、中、高質量濃度（5.00、80.00、1 200.00 ng/mL），鹽酸文拉法辛低、中、高質量濃度（5.30、84.80、1 272.00 ng/mL），鹽酸羅格列酮低、中、高質量濃度（5.00、80.00、1 200.00 ng/mL），硝苯地平低、中、高質量濃度（5.10、81.60、612.00 ng/mL）的質控樣品各5份，分別考察其在-20 ℃冰箱中放置20 d、反復凍融（-20 ℃～室溫）3次、按“2.3”項下方法處理后在儀器自動進樣室（10 ℃）內放置24 h的穩(wěn)定性。結果顯示，各質控樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好，RE均小于20%。

2.5 臨床應用

采用上述UPLC-MS/MS法測定4例患者的血藥濃度。其中，2例患者確診為癲癇，1例聯合使用卡馬西平和丙戊酸鈉治療，1例聯合使用卡馬西平和苯巴比妥治療（效果不佳，需進行用藥調整）；另外2例患者確診為高血壓，均服用硝苯地平治療（效果不佳，需進行用藥調整）。上述患者均按藥品說明書服用治療藥物。因患者個體差異致治療前期效果欠佳或為降低因藥物長期服用的蓄積作用引發(fā)潛在不良反應的風險，采集其靜脈血5 mL進行血藥濃度監(jiān)測。將上述靜脈血置于含肝素鈉抗凝劑的離心管中，以2 292×g離心5 min，取上層血漿，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，各樣本重復測定3次，以當日標準曲線計算其血藥濃度。結果顯示，2例癲癇患者體內卡馬西平的血藥濃度分別為（1 500.41±169.11）、（1 159.01±59.24）ng/mL（RSD分別為11.27%、5.60%，n=3）；2例高血壓患者體內硝苯地平的血藥濃度分別為（14.68±1.92）、（21.18±3.59）ng/mL（RSD分別為16.98%、13.10%，n=3）。

3 討論

目前，關于血液樣本中卡馬西平、文拉法辛、羅格列酮和硝苯地平濃度的檢測方法已有相關報道，主要包括高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）和液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）[9-14]。其中，HPLC法的靈敏度較低且所需血漿量較大；LC-MS或LC-MS/MS法的前處理方法較為復雜，線性范圍較窄，且多適用于單一化合物的檢測。故本研究在已有文獻的基礎上，建立了同時測定上述4種藥物濃度的UPLC-MS/MS法，采用甲醇（含0.1%甲酸）直接沉淀蛋白，相比于文獻報道的液-液萃取法，本法操作更簡單、處理周期更短，且盡可能地避免了前處理環(huán)節(jié)過多所造成的系統誤差，適合于臨床大樣本分析[10，12-13]。本法在流動相的有機相和水相中均加入了0.01%甲酸，此舉可優(yōu)化待測物色譜峰峰形，避免其拖尾。通過梯度洗脫，將復雜的內源性物質先洗脫下來，而待測物在2 min以后出峰，一定程度上降低了基質效應的影響；同時，各待測物分離度良好，有助于分時段進行質譜掃描分析，提高了質譜的響應值。方法學考察結果顯示，本法內源性物質對待測物的干擾小，方法的專屬性好，線性范圍寬于文獻報道[10，14]；同時精密度、準確度良好，可用于臨床生物樣品的定量分析。另外，卡馬西平、文拉法辛和羅格列酮（后兩者為鹽酸鹽）的最低檢測限均小于1.0 ng/mL，表明該方法靈敏度較高；硝苯地平的最低檢測限為1.020 ng/mL，雖高于文獻[14]，但仍能滿足臨床監(jiān)測的要求（硝苯地平在體內代謝期的血藥濃度大于1.0 ng/mL）[15]。本研究選用鹽酸吡格列酮為內標，因其與待測化合物的結構中均含有氮原子，理化性質較為相似，基質效應和提取回收率考察結果也表明選用該化合物作為內標是合適的。

目前，藥品不良反應一直是臨床用藥關注的焦點問題。本研究中的4種藥物均是臨床上治療不同疾病的常用藥物，都具有潛在的不良反應，患者的個體差異、長期用藥等因素均可導致不良反應的發(fā)生，因此其血藥濃度的監(jiān)測顯得十分重要，高效的血藥濃度監(jiān)測方法為藥物治療的有效性和安全性評價提供了技術保障。本研究采用上述UPLC-MS/MS法對臨床患者的血液樣本進行了血藥濃度測定，其中1例患者[服用硝苯地平，體內血藥濃度為（21.18±3.59）ng/mL]自述服藥期間出現了頭脹、頭痛、面部潮紅等癥狀，醫(yī)師根據血藥濃度監(jiān)測結果和患者當時的血壓情況減少了用藥劑量，3 d后復查上述癥狀得以減輕。由于本試驗只測定了4例患者的血漿樣品，且僅測定了其中2種藥物，故仍需增大臨床樣本量進一步考察。另外，臨床上其他部分藥品的說明書也指出其不良反應會影響駕駛者的操作能力，如抗組胺類藥物等，故仍有待進一步增加待測藥物，改進方法，完善此類藥物血藥濃度監(jiān)測平臺的建設。

綜上所述，本研究建立的同時測定人血漿中卡馬西平、文拉法辛、羅格列酮和硝苯地平濃度的UPLC-MS/MS法具有樣品前處理簡單、快速、專屬性強、靈敏度高、準確度和精密度高等特點，可用于臨床患者的血藥濃度監(jiān)測和藥動學研究。

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（收稿日期：2017-02-22 修回日期：2017-11-20）

（編輯：張元媛）