金露梅與珠芽蓼草粉對模擬瘤胃體外發酵的影響

薛世魁 金珍 王雪酈

摘要：以6頭體重35 kg左右、安裝永久性瘤胃瘺管的健康羯羊為瘤胃液供體動物，用持續人工瘤胃裝置（RUSITEC），基礎日糧混合料為底物進行體外發酵試驗，研究添加富含植物次生代謝物的金露梅與珠芽蓼草粉對瘤胃發酵的影響，以篩選天然飼料添加劑。結果表明，基礎日糧中添加10%金露梅和10%珠芽蓼草粉與普通基礎日糧之間，發酵液pH、甲烷、揮發性脂肪酸的產生量及干物質消失率差異均不顯著（P > 0.05），但有降低甲烷產量、提高干物質消化率的趨勢。因此，在本試驗條件下，添加10%金露梅和10%珠芽蓼草粉對瘤胃發酵的作用不顯著，不適合做飼料添加劑。

關鍵詞：植物次生代謝物；體外模擬瘤胃發酵；金露梅；珠芽蓼；草粉

中圖分類號：S816.7 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2018）02-0063-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.02.017

Effects of Grass Powder of Potentilla fruticosa L. and Polygonum viviparum L. on Simulated Rumen Fermentation in Vitro

XUE Shikui 1， JIN Zhen 2， WANG Xueli 1

（1. Animal Health Supervision Institute， Chengguan District， Lanzhou Gansu 730000， China； 2. Animal Disease Prevention and Control Center， Chengguan District， Lanzhou Gansu 730000， China）

Abstract：The 6 healthy wether， weight about 35 kg， was fitted with permanent rumen fistula as rumen fluid donor， with continuous artificial rumen device （RUSITEC）. Basic diet mixture as a substrate in vitro fermentation experiment， the study was done to add grass powder of Potentilla fruticosa L. and Polygonum viviparum L. rich in plant secondary metabolites on rumen fermentation in RUSITEC， with screening of natural feed additives. The results show that the yield and dry matter disappearance rate of fermentation liquid pH，methane and volatile fatty acid had no significant difference （P > 0.05） between basic diets supplemented with grass powder of 10% Potentilla fruticosa L. and 10% Polygonum viviparum L. and ordinary diet， but there is a trend to increase the dry matter degradation and decrease the methane production. Therefore， under the conditions of this experiment， the effect of adding grass powder of grass powder of 10% Potentilla fruticosa L. and 10% Polygonum viviparum L. on rumen fermentation was not significant， it is not suitable to choose as a feed additive.

Key words：Plant secondary metabolites；Simulated rumen fermentation in vitro；Potentilla fruticosa L.；Polygonum viviparum L.；Grass powder

提高飼料轉化率，一直是動物營養學家關注的最重要問題之一。在反芻動物瘤胃厭氧發酵過程中，甲烷的產生意味著飼料能量損失和對環境產生溫室效應。因此，在反芻動物生產中，如何減少瘤胃甲烷排放，提高瘤胃發酵效率，不僅關系到飼料利用效率，而且也與維護大氣環境有關，這已是反芻動物營養研究的一個重要方向[1 ]。然而，至今人們找到唯一有效降低瘤胃甲烷的化學抑制劑是離子載體，它可抑制供給甲烷形成所需的氫氣[2 ]，減少甲烷排放量高達25%[3 ]。但自2006年歐盟各國限制應用抗生素類添加劑以來，綠色飼料添加劑越來越受到廣泛的關注。研究發現，具有特殊生物活性的植物次生代謝物，動物所采食雖然富含這些化合物的飼草料不一定能提供營養，但會影響動物的消化、代謝過程[4 ]，調控瘤胃發酵模式，提高氮存留，減少甲烷排放[5 ]；一些酚類化合物、精油和絲蘭皂甙具有抗菌活性，還可替代抗生素作飼料添加劑[6 ]，所以，在生產實踐中若能科學合理地利用植物次生代謝物，將提高飼料利用率，改變瘤胃發酵模式和產物，最終提高宿主動物生產性能[7 ]。含有高濃度次生代謝化合物的植物也許將是最有潛力的候選添加 劑[3 ]，在瘤胃調控中將有更廣的研究與應用前 景[7 ]。

目前，有人已對一些植物進行了測試，研究了植物性添加劑對瘤胃發酵調控和降低甲烷產量的可能性[8 ]。然而，此類天然綠色添加劑的研發，需要繼續進行大量體外篩選工作[6， 9 ]。基于植物次生代謝物的特殊生物活性，富含這些化合物的植物將被選做候選添加劑[8 ]。在我國青藏高原地區，由于其特殊的地理環境，牧草含有較多植物次生代謝物[10 ]。其中金露梅與珠芽蓼是該區兩種常見植物，也是藏藥原料成分，生物堿類、黃酮類、皂苷類、甾醇類、植物精油、單寧等含量較高[11 - 12 ]。我們利用持續人工瘤胃裝置，研究添加金露梅與珠芽蓼兩種草粉對瘤胃發酵和甲烷產量的影響，以探討其是否適于選做天然綠色添加劑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用日糧各種原料由甘肅農業大學動物科學技術學院科研訓練基地提供。金露梅與珠芽蓼于其生長季的7月底采自甘肅省天祝縣海拔 3 450～3 500 m的金強河高山草地。采樣時隨機剖出10個1 m×1 m的樣方框，采集開花期金露梅嫩枝葉和開花前期珠芽蓼地上部，采后稱鮮重，置于105 ℃烘箱中烘5 min迅速殺青，之后在70 ℃烘干至恒重后經粉碎過1 mm篩備用。所用體外模擬發酵裝置為2010年日本生產的持續動態人工瘤胃裝置RUSITECH（R-S，Shina-gawa）。

1.2 試驗方法

采用完全隨機試驗設計，將金露梅和珠芽蓼草粉以配合飼料中添加劑最高比例10%的標準添加。分3組，分別為對照組（CK）（基礎日糧）、處理1（金露梅替換10%的基礎日糧）、處理2（珠芽蓼替換10%基礎日糧）。基礎日糧參照《中國美利奴育成公羊飼養標準》，以綿羊日增重為50 g對能量和蛋白質需要量配制試驗日糧配方（表1）。精料由玉米和豆粕組成，粗料為苜蓿干草和小麥秸稈，精粗質量比為40∶60。人工瘤胃試驗營養水平（風干基礎）為：干物質901.4 g/kg、粗蛋白93.2 g/kg、消化能8.48 MJ/kg、鈣4.0 g/kg、磷1.8 g/kg。

1.3 人工瘤胃

1.3.1 緩沖溶液配制 人工瘤胃緩沖溶液按McDougall配方配制：NaHCO3 9.8 g/L、Na2HPO4·12H2O 9.3 g/L、NaCl 0.47 g/L、KCl 0.57 g/L、MgSO4·7H2O 0.12 g/L、CaCl2·2H2O 0.045 g/L，蒸餾水1 000 mL。配制時除CaCl2·2H2O以外的試劑用1 000 mL蒸餾水充分溶解后再加入CaCl2·2H2O，然后持續通入CO2，使溶液pH為6.9±0.1[13 ]。

1.3.2 人工瘤胃液準備 瘤胃液采自6頭體重35 kg左右、安裝永久性瘤胃瘺管的健康羯綿羊作為培養液的供體羊，飼喂基礎日糧。每天飼喂2次（08：00、20：00時），自由飲水。晨飼前分別從6頭供體羊瘤胃中采集瘤胃液約3 500 mL，混合后用保溫瓶迅速帶回實驗室，用四層紗布過濾，整個操作于39 ℃水浴中進行。過濾后取3 200 mL瘤胃液搖勻分成8份，加入已分別裝有400 mL緩沖液的8個發酵罐內，持續通入CO2氣體2～3 min保持發酵罐內部厭氧環境。

1.3.3 人工瘤胃工作條件參數 人工瘤胃的工作條件為稀釋率0.7 /d，緩沖液流量0.39 mL/min，流出液口篩網孔徑為1.2 mm，補料量為20 g/d，發酵罐內溫度為39 ℃，充CO2至厭氧環境，緩沖液與瘤胃液按體積比1∶1比例添加。

1.3.4 人工瘤胃操作與樣品采集 將供試原料風干，粉碎，按試驗設計準確稱取后混合均勻，配制試驗全期的總用量。稱取10 g分裝于孔徑為50 μm、尺寸為7 cm×13 cm的尼龍袋中備用。每天分別于08：30時和20：30時進行補料。首先向每個發酵罐加入預先準備好的混合日糧10 g，補料完畢充CO2氣體2～3 min，以維持發酵罐內厭氧環境。

1.3.5 發酵試驗 連續進行兩期發酵試驗。每期試驗包括7 d預試期和2 d正試期。于正試期第1天用集氣袋收集24 h的產氣并記錄產氣量，將部分氣體轉移到采氣袋，以備測定甲烷產量。第2天，投料后3、6、9、24 h經取樣口采集發酵液，加1滴飽和HgCl溶液后立即測定pH，然后于-20 ℃冷凍保存，以備其他發酵產物的測定。收集發酵罐內尼龍袋食糜，于65 ℃烘箱烘干，粉碎，待測干物質降解率。

1.4 測定指標及樣品分析方法

1.4.1 發酵24 h總產氣量 用集氣袋收集，然后用氣量計測定總量。

1.4.2 不同時間點發酵液pH 用pH計（pHS-3C，上海雷磁儀器廠）測定。

1.4.3 甲烷 用氣相色譜儀（BeifenHP-3420A型）測定。測定條件為柱溫80 ℃，氣化室溫度100 ℃，檢測室溫度120 ℃；載氣使用高純氮氣，總壓力130 kPa，總流量30.2 mL/min，柱流量1.7 mL/min，線速度39.8 cm/s，分流比15，吹掃流量3 mL/min，循環流量8 mL/min，H2流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min[14 ]。

1.4.4 揮發性脂肪酸（VFA） 用氣相色譜儀（Beifen HP-3420A型）測定。樣品預處理：解凍-20 ℃保存的發酵液樣品，10 000 g離心10 min，取上清 液1 mL加25%偏磷酸0.1 mL，靜置30 min，在 10 000 g下離心10 min，保留上清液待測。色譜條件為色譜柱2 m×3 mm內裝5%聚二乙二醇丁二酸酯（DEGS）+1%磷酸的不銹鋼柱。儀器條件為柱溫以2 ℃/min由110 ℃升至120 ℃，進樣器、檢測器溫度200 ℃；載氣N2流速20 mL/min、氫氣流速30 mL/min、空氣流速300 mL/min[15 ]。

1.5 數據處理與統計分析

基礎數據用Excel整理后，用SPSS 12.0統計軟件進行單因素方差分析處理，顯著性水平為0.05。差異顯著性用Duncan氏法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 金露梅和珠芽蓼草粉對干物質消失率、 總產氣量與甲烷產量的影響

從表2可以看出，與對照相比，添加10%金露梅和10%珠芽蓼的處理，干物質消失率較高，而總產氣量和甲烷產量與均較對照有所下降，但差異都不顯著（P > 0.05）。

2.2 金露梅和珠芽蓼草粉對瘤胃液pH的影響

從表3可以看出，添加10%的金露梅和10%珠芽蓼時，人工瘤胃發酵罐內不同時間瘤胃液pH變化范圍在6.83～6.97，沒有產生顯著影響（P >0.05）。發酵24 h后，各處理的pH均低于投料后3 h的測定值（P > 0.05）。

2.3 金露梅和珠芽蓼草粉對瘤胃液揮發性脂肪酸濃度的影響

從表4可以看出，基礎日糧中添加10%金露梅和10%珠芽蓼的處理，發酵產生的丙酸和丁酸濃度均高于對照，而乙酸、戊酸濃度低于對照，差異均不顯著（P > 0.05）。各處理乙酸/丙酸和（乙酸+正丁酸）/丙酸比值差異不顯著，添加10%金露梅和10%珠芽蓼的處理均低于對照。各處理的總揮發性脂肪酸含量差異不顯著（P > 0.05），但添加10%金露梅和10%珠芽蓼處理的測定結果略高于對照。

3 小結與討論

研究結果表明，基礎日糧中添加10%金露梅和10%珠芽蓼草粉與普通基礎日糧之間發酵液pH、甲烷、揮發性脂肪酸的產生量及干物質消失率差異均不顯著（P > 0.05），但有降低甲烷產量，提高干物質消化率的趨勢。體外發酵液pH為6.83～6.94，高于王永梅等（6.04～5.90）和陸燕等人的試驗結果（6.61～6.76）[16 - 17 ]，總體高于不用瘤胃模擬裝置的體外發酵試驗結果（6.50～6.40）[18 ]，原因可能與本試驗過程中，人工瘤胃裝置通過蠕動泵持續不斷的泵入人工唾液，發酵產物不斷溢出模擬瘤胃有關。pH變化范圍處于瘤胃液正常范圍（pH為6.4～7.4）內，適合瘤胃內微生物的生存條件，不會影響瘤胃的發酵功能[19 ]。

許多體外試驗發現，植物次生代謝物對動物瘤胃發酵的影響效果不同，有時甚至得出自相矛盾的結果，是因為植物次生代謝物的添加劑量、化學組成、純度、日糧類型、瘤胃微生物的適應性， 以及植物次生代謝物存在形式、體外發酵裝置都會影響瘤胃發酵[6 ]。有文獻報道，與本試驗同年采集時間接近的8月1號所采金露梅與珠芽蓼中縮合單寧含量分別為4.51%和2.76%，其純化縮合單寧在體外產氣法試驗中，對總產氣量和甲烷產量的抑制作用較明顯[20 ]。而在本試驗，處理組較對照的產氣量和甲烷產量僅有降低的趨勢，也許是10%添加量中的單寧不足以產生顯著的影響，再者，日糧類型與縮合單寧純度都可能是影響瘤胃發酵的因素。有研究表明，飼料消化率與體外培養時的產氣量具有高度相關性，產氣量越高，飼料在瘤胃內的降解率越高[21 ]。但本試驗處理組干物質降解率變化趨勢與產氣量和甲烷產量相反，也許是由于開花期金露梅與開花前期的珠芽蓼本身消化率較高，故處理組的干物質降解率較對照高。雖然金露梅與珠芽蓼含有較多植物次生代謝物，但10%添加量中的單寧不足以影響微生物對纖維的消化，最終表現是干物質降解率和總產氣量，以及甲烷產量差異均不顯著[6 ]。

瘤胃中的飼料被降解，產生揮發性脂肪酸（VFA）的同時產生大量甲烷（CH4）。揮發性脂肪酸主要包括乙酸、丙酸、丁酸等，其含量和組成，是反映瘤胃微生物發酵活動的重要指標。本試驗三組處理的總揮發性脂肪酸測定結果與王銀山等人的報道一致[22 ]。在瘤胃發酵中，生成乙酸和丁酸的過程產生氫，甲烷可消除發酵中過多的氫，是氫的“平衡器”，因此氫是限制甲烷產生的第一要素。當乙酸和丁酸比例較高時，產生較多的氫，甲烷生成量增加；而當丙酸比例增高時，相應甲烷產量降低。所以添加金露梅和珠芽蓼后，乙酸、丁酸濃度，乙酸/丙酸及甲烷產量均有低于對照組的趨勢，符合瘤胃發酵一般規律。曾有研究報道，瘤胃發酵產生的甲烷量，對植物次生代謝物，有劑量依賴性[23 ]。本試驗添加金露梅和珠芽蓼降低甲烷產量的效果不顯著，可能與添加量有關。

戊酸與含4個或5個碳原子的支鏈脂肪酸2-甲基丁酸、異丁酸和異戊酸，合稱為異位酸[24 ]。它們是促進瘤胃纖維分解菌生長的主要營養物質，對瘤胃內纖維的降解有重要影響，可提高瘤胃對植物細胞壁的消化能力，促進纖維的消化[25 ]。從本試驗數據可知，與對照相比，添加兩種草粉的處理組戊酸和異丁酸比例有所下降，而干物質降解率有較高的趨勢，推測可能是戊酸和異丁酸被纖維分解菌利用，促進了分解菌繁殖，利于干物質降解率；兩種草粉可能對瘤胃微生物區系有影響，進而對瘤胃發酵粗纖維飼料有改善。而處理組比對照異戊酸測定值較高（P > 0.05），可能是由于異戊酸與飼料纖維降解作用無關[26 ]。

在本試驗條件下，添加10%金露梅和10%珠芽蓼草粉，對瘤胃發酵的作用效果不顯著；也許與兩種植物的添加量，或者日糧類型有關，導致結果不顯著。據此認為，選擇10%金露梅和10%珠芽蓼草粉作添加劑不可行。

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（本文責編：陳 偉）