腫瘤免疫微環(huán)境評價(jià)在療效預(yù)測中的研究進(jìn)展*

腫瘤微環(huán)境免疫特征已經(jīng)被列入腫瘤十大特征之一［1］，其一方面能夠在預(yù)測患者臨床預(yù)后中發(fā)揮作用；另一方面，還能預(yù)測患者臨床化療或者放療等的臨床療效［2-3］。因此，分析腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的種類和分布等，具有重要的臨床意義。

研究顯示［4-7］，腫瘤局部浸潤著各種免疫細(xì)胞亞群，包括巨噬細(xì)胞（macrophage，Mφ）、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（natu?ral killer cell，NK）、初始和記憶性CD8+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞，以及不同的效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群，如Th（helper T cell）1型細(xì)胞、Th2型細(xì)胞、Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）等。然而，由于腫瘤類型的不同，浸潤的免疫細(xì)胞也不同，甚至同種病理類型的腫瘤、不同的腫瘤患者間，浸潤的免疫細(xì)胞亞群也具有差異。這些免疫細(xì)胞亞群又因在腫瘤微環(huán)境中分布的位置不同有所區(qū)別。因此，如何建立有效的免疫評價(jià)體系，成為目前亟待解決的問題。

1 免疫結(jié)構(gòu)的特征及其臨床意義

通過免疫組織化學(xué)染色分析腫瘤局部浸潤的免疫細(xì)胞亞群的數(shù)量和位置，可以得到腫瘤微環(huán)境的免疫結(jié)構(gòu)特征［8］（表1）。Mφ、肥大細(xì)胞、DC和髓源性免疫抑制性細(xì)胞（myeloid derived immune suppressor cell，MDSC）分布于腫瘤的中心區(qū)和腫瘤周圍［9］。NK細(xì)胞則主要位于腫瘤基質(zhì)。未成熟DC主要位于腫瘤中心區(qū)，而成熟DC和B細(xì)胞多見于次級淋巴組織［10］。研究顯示，非小細(xì)胞肺癌［11］、結(jié)腸癌［12］、黑色素瘤［13］和頭頸部腫瘤［14］的中心區(qū)和腫瘤浸潤邊緣均有T細(xì)胞分布。其中CD8+T細(xì)胞，主要分布在腫瘤浸潤邊緣。但是在結(jié)腸癌中［12］，記憶性T細(xì)胞主要聚集在腫瘤中心區(qū)，其比例隨著腫瘤的增大而降低。

表1 不同免疫細(xì)胞亞群的表型和功能特征

此外，免疫細(xì)胞群的密度不同，患者預(yù)后也不同［15］。高密度的CD3+T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞與疾病無進(jìn)展生存（progression free survival time，PFS）和總生存（overall survival time，OS）延長顯著相關(guān)［12］。研究報(bào)道，卵巢腫瘤中心區(qū)的Treg細(xì)胞數(shù)量與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。然而，一些淋巴瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌和頭頸部腫瘤的相關(guān)研究結(jié)果提示，腫瘤局部Tregs細(xì)胞的密度與患者的總生存呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果的差異可能是由于細(xì)胞密度的不同造成的，密度較低時(shí)會(huì)降低免疫細(xì)胞的作用效果。

2 免疫評分體系的建立及其臨床實(shí)踐

腫瘤局部復(fù)雜的免疫細(xì)胞組成通過協(xié)同作用或者相反的作用共同影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，如何分析腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和組織微環(huán)境這三個(gè)系統(tǒng)之間的相互作用在臨床中的意義，成為研究者面對的難題。

Pagès等［12］針對29例早期（TNMⅠ期和Ⅱ期）大腸癌組織進(jìn)行基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤局部浸潤的CD45RO+細(xì)胞越多，Th1類和CD8+殺傷性T細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)越強(qiáng)。前期研究顯示，無淋巴和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的局限性結(jié)腸癌患者，手術(shù)治療后仍有25%復(fù)發(fā)，因此，亟需一種能夠判斷患者能否從輔助化療獲益的方法。該研究組采用免疫組織化學(xué)染色的方法，在兩個(gè)隊(duì)列共計(jì)602例早期（TNMⅠ期和Ⅱ期）大腸癌組織中檢測了CD8和CD45RO的表達(dá)，并將腫瘤分為中心區(qū)域（tumor center，CT）和交界區(qū)域（invasive margin，IM）。按照CD8和CD45RO的表達(dá)密度不同，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算出臨界值，并按照臨界值將CD8和CD45RO的表達(dá)分為高密度和低密度；若免疫細(xì)胞在CT區(qū)或IM區(qū)為高密度表達(dá)，記作1分，低密度表達(dá)記作0分，CD8和CD45RO在兩種不同分區(qū)的表達(dá)得分相加為免疫得分。按照這種方式，免疫評分被分為I0～I(xiàn)4共5級，CT區(qū)和IM區(qū)均為高密度的定義I4，CT區(qū)和IM區(qū)均為低密度的定義為I0，并分析患者PFS和OS與免疫評分的相關(guān)性。使用免疫評分的方法分組后，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)免疫評分較高（I4）的分組5年OS為86.2%，PFS為95.2%；相反，免疫評分較低的分組（I0～I(xiàn)1）中，72%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，5年OS僅27.5%。由此可見，I0～I(xiàn)1的患者能夠從輔助化療中獲益。為了進(jìn)一步驗(yàn)證免疫評分體系的預(yù)測效果，該研究組［16］繼續(xù)擴(kuò)展研究樣本和評價(jià)指標(biāo)，在599例包括臨床各期的大腸癌患者（TNMⅠ～Ⅳ期）中分析了免疫評分與患者預(yù)后的關(guān)系，得到相似的結(jié)論，并將納入免疫評分的免疫細(xì)胞亞群擴(kuò)展為CD3/CD45RO、CD3/CD8或CD8/CD45RO組合［12］。同時(shí)，其采用Cox回歸進(jìn)行了多因素分析，結(jié)果顯示納入免疫評分評價(jià)體系后，因腫瘤的侵襲與免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱顯著相關(guān)，免疫評分超越TNM分期成為預(yù)測患者無疾病生存（diesease free survial，DFS）和OS的更加優(yōu)越的一套評價(jià)系統(tǒng)。

在2012年世界免疫治療理事會(huì)會(huì)議上，由腫瘤免疫治療協(xié)會(huì)牽頭建立了免疫評分特別工作組，以推廣上述評價(jià)體系的臨床應(yīng)用［17-19］。目前已經(jīng)有來自17個(gè)國家的23個(gè)中心，3 855例患者按照免疫評分進(jìn)行評估，其中通過了質(zhì)量控制而納入統(tǒng)計(jì)的共2 667例患者，計(jì)數(shù)的CD3+T細(xì)胞數(shù)量達(dá)3.52×108。結(jié)果顯示，臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的腫瘤患者，免疫評分越高，無疾病生存時(shí)間越長；在臨床Ⅱ期的結(jié)腸癌患者中，較低的免疫評分（I0～I(xiàn)1）是患者預(yù)后不良的高危因素。多因素分析結(jié)果提示，除了微衛(wèi)星不穩(wěn)定、T分期、N分期、年齡和性別，免疫評分也是評價(jià)患者OS和PFS的一項(xiàng)重要影響因素。這些結(jié)果基本與前期單中心結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫評分的有效性和可重復(fù)性。

此外，通過研究結(jié)腸癌組織中微衛(wèi)星不穩(wěn)定與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與腫瘤突變負(fù)荷有關(guān)，與腫瘤局部Th1反應(yīng)、記憶性T細(xì)胞增加和免疫評分增加呈正相關(guān)；繼續(xù)進(jìn)行多因素分析顯示，在評價(jià)結(jié)腸癌患者PFS和OS中，免疫評分優(yōu)于微衛(wèi)星不穩(wěn)定，與腫瘤患者預(yù)后的相關(guān)性更密切［20］。

近年，免疫評分在腫瘤預(yù)后評估中的報(bào)道也逐漸擴(kuò)展到胃癌［21］、惡性黑色素瘤［13］、頭頸部腫瘤［14］和腎癌［22］等多種類型的腫瘤研究中。研究認(rèn)為，免疫評分能夠用于所有類型腫瘤的預(yù)后評價(jià)。Berghoff等［23］評估了腦轉(zhuǎn)移患者CD8+T細(xì)胞的密度與臨床預(yù)后的關(guān)系。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測116例腦轉(zhuǎn)移組織中CD3、CD8、CD45RO、Foxp3、程序性死亡受體（programmed death-1，PD-1）及其配體PD-L1，結(jié)果顯示，99.1%（115/116）的組織有腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）浸潤，28.4%（19/67）的組織顯示PD-L1陽性，但是PD-L1的表達(dá)與TIL的密度無關(guān)（P＞0.05）。CD3+、CD8+和CD45RO+細(xì)胞密度與中位OS呈正相關(guān)。多因素分析結(jié)果顯示免疫評分是患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P＜0.001）。

3 免疫圖譜與臨床預(yù)后

隨著新型檢測技術(shù)的應(yīng)用，質(zhì)譜流式檢測技術(shù)和單細(xì)胞測序技術(shù)逐漸應(yīng)用到腫瘤免疫特征檢測領(lǐng)域，其能夠描繪出圍繞腫瘤的免疫細(xì)胞特征圖譜，成為針對腫瘤免疫微環(huán)境的新型評價(jià)手段［24-26］。Chevr?ier等［24］采用質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)和多色免疫熒光技術(shù)相結(jié)合的方法，分析了73例腎透明細(xì)胞癌和5例健康對照的臨床標(biāo)本，將單核-巨噬細(xì)胞分為17個(gè)亞群，將T細(xì)胞劃分為22個(gè)亞群，發(fā)現(xiàn)了與疾病DFS相關(guān)的免疫構(gòu)成，初步描述了腎透明細(xì)胞癌微環(huán)境的免疫圖譜。

該研究顯示，在腎透明細(xì)胞癌微環(huán)境中，T細(xì)胞是主要的免疫細(xì)胞群，占微環(huán)境細(xì)胞比例平均為51%；髓系細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞所占比例依次為31%、9%和4%。粒細(xì)胞和成熟漿細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中比例較少。進(jìn)一步分析顯示，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）異質(zhì)性最大，其次是CD8+T細(xì)胞，而CD4+T細(xì)胞表型相對一致。該研究進(jìn)一步證實(shí)腫瘤特異性和組織特異性巨噬細(xì)胞具有表型多樣性特點(diǎn)，鑒定出HLA-DRhighCD68highCD64highCD11b-TAM或HLADRhighCD68highCD64highCD36-TAM僅存在于Ⅱ期及以上腎透明細(xì)胞癌中，此外，CD204+CD38+CD163-CD206-CD169-TAM比例與腎透明細(xì)胞癌患者PFS呈正相關(guān)，而CD204+CD206-CD163-CD169-TAM和CD204+CD163+CD206+CD169+TAM的比例與腎透明細(xì)胞癌患者PFS呈負(fù)相關(guān)。在CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞亞群中，PD-1+細(xì)胞比例均增高。但是，僅有少量PD-1+CD8+T細(xì)胞群同時(shí)表達(dá)其他免疫抑制因子（如Tim-3、CTLA-4）。根據(jù)活化因子（CD38）和共刺激分子（ICOS和4-1BB）表達(dá)的差異，PD-1+CD8+T細(xì)胞分為不同的亞群，這提示腎癌微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞群異質(zhì)性較大。與之不同的是，PD-1+CD4+T細(xì)胞顯示出相似的表型，共表達(dá)抑制性分子CD38和Tim-1，低表達(dá)ICOS和4-1BB。該研究揭示了影響腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的特異性的免疫細(xì)胞亞群特征，充分展示了腎癌患者免疫細(xì)胞的多樣性特點(diǎn)。

Lavin等［25］篩選28例肺腺癌患者外周血、非腫瘤肺組織和肺癌標(biāo)本，使用質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)和多因子檢測技術(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在Ⅰ期腫瘤患者，腫瘤局部已經(jīng)顯示出大量MDSC浸潤，NK細(xì)胞和CD141+DC細(xì)胞減少，而CD1c+DC、PPARγhighMφ、PD-1+T細(xì)胞均增多。此外，該研究還鑒定出CD39highCD38highPD-1highCTLA-4highTregs細(xì)胞群，同樣也顯著增多。這些免疫細(xì)胞特征構(gòu)成了早期肺腺癌患者個(gè)體化的“免疫特征圖譜”，為進(jìn)一步開展針對早期肺腺癌的特異性免疫療法提供了思路。

在免疫治療過程中，有可能因?yàn)槊庖呒?xì)胞浸潤而產(chǎn)生假性進(jìn)展，從而影響療效的評價(jià)。近來有學(xué)者提出通過繪制動(dòng)態(tài)免疫圖譜的方式，監(jiān)測患者的免疫反應(yīng)［27］。通過治療過程中連續(xù)取樣，繪制動(dòng)態(tài)免疫圖譜，有利于識別與治療有關(guān)的動(dòng)態(tài)生物標(biāo)志物，監(jiān)測患者的免疫治療效果，區(qū)分假性進(jìn)展，明確具有潛在反應(yīng)性的患者，使更多患者獲益［28］。

4 腫瘤免疫微環(huán)境評價(jià)在免疫檢查點(diǎn)藥物治療中的應(yīng)用

免疫治療為抗腫瘤治療帶來了巨大革新，其中免疫檢查點(diǎn)抑制劑的進(jìn)展最為矚目。目前臨床上應(yīng)用較多的免疫檢查點(diǎn)藥物主要是PD-1/PD-L1抑制劑，在晚期黑色素瘤［29］和非小細(xì)胞肺癌［30］等多種實(shí)體瘤治療中為患者帶來長期生存獲益。然而，接受藥物治療的患者，客觀有效率僅10%～30%［31］。已知，腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤浸潤免疫細(xì)胞失能的主要機(jī)制之一，也是與PD-1藥物應(yīng)答相關(guān)的主要機(jī)制。早期研究通過檢測腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)，顯示PD-L1陽性患者的客觀緩解率僅36%［32］。該研究進(jìn)一步分析了腫瘤和機(jī)體免疫系統(tǒng)作用的4種形式：1）腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1且周圍大量免疫細(xì)胞浸潤，這種情況是因?yàn)槊庖呒?xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ等誘導(dǎo)了PD-L1的上調(diào)，此時(shí)PD-1抗體治療效果最好；2）無免疫細(xì)胞浸潤也無PD-L1表達(dá)，此時(shí)需要采用其他方法增加腫瘤局部免疫細(xì)胞浸潤；3）腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá)PD-L1，但無免疫細(xì)胞浸潤，在約1%的黑色素瘤中，PD-L1在腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá)，這是由于癌基因驅(qū)動(dòng)的腫瘤內(nèi)源性表達(dá)；4）腫瘤內(nèi)有大量免疫細(xì)胞浸潤，但腫瘤無PD-L1表達(dá)，這時(shí)腫瘤局部浸潤的可能多是免疫抑制細(xì)胞。此外，以上情況也可能同時(shí)出現(xiàn)，如檢測頭頸部腫瘤組織顯示，PD-L1在腫瘤中廣泛低表達(dá)，而在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中高表達(dá)。

近年研究［33］顯示多種因素可能影響抗PD-1/PDL1治療的效果，主要包括：1）針吸活檢時(shí)由于組織較小檢測不到；2）腫瘤組織中PD-L1在不同部位可能表達(dá)強(qiáng)度不同，造成檢測差異；3）治療過程中，PD-L1的表達(dá)隨著治療進(jìn)行可能呈現(xiàn)出表達(dá)差異；4）PD-L1表現(xiàn)為膜表達(dá)和漿表達(dá)兩種形式，僅膜表達(dá)的腫瘤細(xì)胞能夠與PD-1+T細(xì)胞相互作用；5）由于抗體不同，PD-L1特異性和親和力不同，造成檢測結(jié)果可能出現(xiàn)差異；6）PD-L1能夠在腫瘤微環(huán)境中多種類型細(xì)胞表達(dá)。研究顯示，20%的乳腺癌組織中及其與之相鄰的腫瘤浸潤免疫細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞）高表達(dá)PD-L1；在胃腸道等腫瘤組織中PD-L1常表達(dá)于免疫細(xì)胞而非腫瘤細(xì)胞，其中又以巨噬細(xì)胞為主。這些PD-L1+免疫細(xì)胞的意義尚需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，這些原因均給抗PD-1/PD-L1的療效預(yù)測帶來了挑戰(zhàn)。因此，腫瘤免疫微環(huán)境的細(xì)致分析，對于更準(zhǔn)確地預(yù)測免疫治療的效果至關(guān)重要。

5 結(jié)語

腫瘤局部微環(huán)境免疫細(xì)胞的特征，通過精細(xì)描繪不同腫瘤患者的免疫細(xì)胞定位、亞群和表型特點(diǎn)，能夠?yàn)榛颊咛峁┯嗅槍π缘拿庖忒煼ǎ岣呙庖邫z查點(diǎn)療法的臨床療效，也為進(jìn)一步開發(fā)新型的免疫療法奠定了基礎(chǔ)。相信隨著研究的不斷深入，腫瘤微環(huán)境免疫特征也將進(jìn)一步豐富和完善，并更好地指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

（2018-03-16收稿）

（2018-06-11修回）