基于環(huán)烯醚萜苷類成分評價不同種質地黃的質量Δ

耿曉桐，謝彩俠，張楠，李金平，陳瓊（1.信陽農林學院制藥工程學院，河南 信陽 6000；.河南中醫(yī)藥大學藥學院，鄭州 50000；.信陽師范學院招生就業(yè)處，河南 信陽 6000；.河南息半夏藥業(yè)有限公司，河南 信陽 6000）

地黃Rehmanniaglutinosa是玄參科地黃屬多年生草本植物，始載于《神農本草經》，含有環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、糖類、紫羅蘭酮、氨基酸類等多種化學成分[1－3]，具有增強免疫力、降血糖、抗氧化等多種功效[4]。明代李時珍在《本草綱目》中曰：“今人以懷慶地黃為上，亦各處隨時興廢不同爾”，這說明自古以來河南一直為地黃的道地產區(qū)，故河南產地黃亦稱為“懷地黃”。

河南作為地黃道地產區(qū)，種植著不同種質（主要有85-5、金九、BX、BJ-1、山東、QH-1）的地黃[1－2，5－6]，不同種質的地黃其表型性狀差異較大[5]，從而影響了地黃的道地性以及臨床藥效。2020版《中國藥典》（一部）規(guī)定，地黃的指標性成分為梓醇和地黃苷D[7]，二者均屬于環(huán)烯醚萜苷類成分[6]；另外，已報道的地黃苷A也屬于環(huán)烯醚萜苷類成分，這類成分多以益母草苷為母體結構，具有良好的免疫活性，還可促進神經功能恢復[8－11]。由此推測，環(huán)烯醚萜苷類成分可能是地黃的主要特征成分。基于此，本研究以85-5、金九、BX、BJ-1、山東、QH-1 6種種質共18批地黃藥材為研究對象，采用紫外分光光度法和高效液相色譜法測定總環(huán)烯醚萜苷、梓醇、地黃苷D、地黃苷A及益母草苷的含量，再利用聚類分析、因子綜合分析及偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）等多元統(tǒng)計學方法對不同種質地黃的質量進行分析，以期為地黃的質量評價與控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有KQ-700DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、AL204型萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、MS105DU型十萬分之一電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]、101-3AB型電熱恒溫鼓風干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、WFZUV-2000型紫外-可見分光光度計[尤尼柯（上海）儀器有限公司]、Waters2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有梓醇（成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-17102510，純度99.46%），地黃苷A、地黃苷D（四川維克奇生物科技有限公司，批號分別為150513、150412，純度均不低于98.00%），益母草苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號L10A6Y2298，純度98.00%），甲醇、無水乙醇（天津市致遠化學試劑有限公司，分析純），2，4-二硝基苯肼（天津市大茂化學試劑廠，分析純）；其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

本研究所用85-5、金九、BX、BJ-1、山東、QH-1共6種種質地黃均來自于道地產區(qū)河南省焦作市溫縣武德鎮(zhèn)亢村地黃種植基地，每種種質地黃在其生長期內均統(tǒng)一管理。根據地黃的生長發(fā)育規(guī)律，在地黃成熟期進行采收，每種種質地黃均隨機選取10株長勢一致的植株，分別采集其塊根。將新鮮地黃塊根洗凈，切成約5 mm長的小塊，于55℃條件下干燥后，打粉過50目篩，保存于干燥器中備用。不同種質的地黃樣品信息見表1。

表1 不同種質的地黃樣品信息

2 方法與結果

2.1 地黃中總環(huán)烯醚萜苷的含量測定方法

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取地黃粉末約1.0 g，加70%乙醇10 mL，稱質量，超聲提取45 min；補足減失的質量，過濾，取續(xù)濾液至50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容，搖勻；精密量取上述定容后的溶液2.5 mL于50 mL容量瓶中，再加70%乙醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取梓醇對照品2.10 mg，置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇定容，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得梓醇質量濃度為0.084 0 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 待測樣品的處理 取供試品溶液或對照品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入1 mol/L鹽酸溶液2 mL，搖勻，于90 ℃水浴15 min；室溫靜置放冷，加2，4-二硝基苯肼-乙醇溶液0.5 mL，搖勻，于90℃水浴25 min；室溫靜置放冷，再加入1 mol/L NaOH-乙醇溶液3 mL，搖勻，室溫靜置1 h。以70%乙醇作為空白對照，采用紫外分光光度法[12]，于462 nm波長下檢測樣品的吸光度。每份樣品重復測定3次。

2.1.4 標準曲線的繪制 分別配制梓醇質量濃度分別為0.017 6、0.034 4、0.043 1、0.053 8、0.067 2、0.084 0 mg/mL的對照品溶液，按“2.1.3”項下方法測定吸光度，以梓醇質量濃度為橫坐標（X）、吸光度為縱坐標（Y），進行線性回歸，得到總環(huán)烯醚萜苷的回歸方程為Y＝10.793 0X－0.098 4（r＝0.999 2），檢測質量濃度線性范圍為0.017 6～0.084 0 mg/mL。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.2”項下對照品溶液，按“2.1.3”項下方法處理后，采用紫外分光光度法[12]，連續(xù)測定6次，記錄吸光度值，計算得總環(huán)烯醚萜苷吸光度的RSD為0.97%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（編號S17）按“2.1.3”項下方法處理后，于室溫放置0、30、60、90、120、150 min后，采用紫外分光光度法[12]，連續(xù)測定6次，記錄吸光度值，計算得總環(huán)烯醚萜苷吸光度的RSD為1.43%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置150 min內穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性試驗 稱取S17樣品6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下方法處理后，采用紫外分光光度法[12]測定吸光度，根據標準曲線計算總環(huán)烯醚萜苷含量。結果顯示，總環(huán)烯醚萜苷含量的RSD為3.86%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取S17樣品9份，各0.5 g，按與已知成分含量0.5∶1、1∶1、1.5∶1的比例分別加入梓醇對照品3.375、6.750、10.125 mg，各比例平行3份，按“2.1.1”及“2.1.3”項下方法制備供試品溶液并處理后，采用紫外分光光度法[12]測定吸光度，再根據標準曲線計算總環(huán)烯醚萜苷含量，并計算加樣回收率。結果顯示，總環(huán)烯醚萜苷的平均加樣回收率為97.39%，RSD為1.77%（n＝9），表明該方法準確可靠。

2.2 地黃中梓醇的含量測定方法

根據2020版《中國藥典》（一部）地黃“含量測定”項下方法測定梓醇的含量[6]。精密稱取梓醇對照品5.79 mg，置于5 mL容量瓶中，加流動相定容，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得梓醇質量濃度為1.158 mg/mL的對照品母液。另按上述藥典方法制備供試品溶液。取梓醇對照品母液和供試品溶液適量，按上述方法進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，梓醇色譜峰分離度較好，無干擾。結果見圖1。

圖1 梓醇的高效液相色譜圖

取上述梓醇對照品母液，梯度稀釋成梓醇質量濃度分別為0.063 7、0.379 0、0.593 0、0.741 1、1.158 0 mg/mL的系列溶液，按2020版《中國藥典》（一部）地黃“含量測定”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標（Y）、質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，得到回歸方程為Y＝2 881 963.989X－159 447.8927（r＝0.999 5），梓醇的檢測質量濃度線性范圍為0.063 7～1.158 0 mg/mL。

2.3 地黃中地黃苷D、地黃苷A、益母草苷成分的含量測定方法

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（體積比4∶96）；檢測波長為205 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為20 μL[13]。

2.3.2 對照品溶液的制備 分別精密稱量地黃苷A、地黃苷D對照品各5.98 mg，置于不同的10 mL容量瓶中，以流動相溶解并定容，經0.22 μm微孔濾膜過濾，配制成地黃苷A、地黃苷D質量濃度均為0.598 0 mg/mL的單一對照品溶液。另精密稱取益母草苷對照品5.16 mg，置于5 mL容量瓶中，以流動相溶解并定容，經0.22 μm微孔濾膜過濾，配制成益母草苷質量濃度為1.032 0 mg/mL的單一對照品溶液。取上述各成分單一對照品溶液適量，混合，即得混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱量地黃粉末0.5 g，置于錐形瓶中，加入60%甲醇50 mL，稱定質量；超聲提取40 min，冷卻至室溫，補足減失的質量，過濾；取續(xù)濾液20 mL于蒸發(fā)皿中，水浴揮干，殘渣以流動相溶解并定容至10 mL容量瓶中，即得。

2.3.4 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.3.2”項下混合對照品溶液和“2.3.3”項下供試品溶液適量，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，地黃苷D、地黃苷A、益母草苷色譜峰的分離度均較好，無干擾，結果見圖2。

圖2 地黃苷D、地黃苷A、益母草苷的高效液相色譜圖

2.3.5 線性關系考察 分別精密吸取“2.3.2”項下地黃苷D、地黃苷A、益母草苷單一對照品溶液各適量，用流動相分別稀釋成地黃苷D質量濃度分別為0.037 4、0.074 8、0.149 5、0.299 0、0.598 0 mg/mL的系列溶液，地黃苷A質量濃度分別為0.026 3、0.100 3、0.196 0、0.306 2、0.382 7、0.598 0 mg/mL的系列溶液，益母草苷質量濃度分別為0.045 4、0.173 1、0.338 1、0.660 4、1.032 0的系列溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y）、各成分質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸。結果顯示，地黃苷D、地黃苷A、益母草苷成分在各自質量濃度范圍內均呈現(xiàn)出良好的線性關系，具體見表2。

表2 地黃中地黃苷D、地黃苷A、益母草苷的線性關系考察結果

2.3.6 精密度考察 取“2.3.2”項下各單一對照品溶液適量，按“2.3.1”色譜條件重復進樣6次，計算得地黃苷D、地黃苷A、益母草苷峰面積的RSD分別為3.01%、2.51%、0.74%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液（S1樣品）于室溫放置0、1、2、3、4、5 h時，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算得地黃苷D、地黃苷A、益母草苷峰面積的RSD分別為1.80%、2.00%、0.51%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置5 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復性考察 取S1樣品6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.3.1”色譜條件進樣測定，再根據標準曲線計算地黃苷D、地黃苷A、益母草苷的含量。結果顯示，這3種成分含量的RSD分別為1.53%、2.77%、1.53%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 精密稱取S7樣品9份，各0.25 g，按照與已知成分含量0.5∶1、1∶1、1.5∶1的比例分別加入地黃苷D對照品0.607 9、1.215 8、1.823 7 mg，地黃苷A對照品0.561 4、1.122 8、1.684 2 mg，益母草苷對照品 0.489 4、0.978 8、1.468 2 mg，各比例平行 3份；按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，再根據標準曲線計算含量，并計算加樣回收率。結果顯示，地黃苷D、地黃苷A、益母草苷的平均加樣回收率分別為98.46%、97.51%、99.08%，RSD分別為1.85%、2.00%、1.24%（n＝9），表明該方法準確可靠。

2.4 不同種質地黃中環(huán)烯醚萜苷類成分的含量測定

2.4.1 不同種質地黃中總環(huán)烯醚萜苷的含量測定 取18批地黃樣品按“2.1.1”及“2.1.3”項下方法制備供試品溶液并處理后，采用紫外分光光度法[12]測定樣品中總環(huán)烯醚萜苷的含量。結果顯示，6種種質地黃中總環(huán)烯醚萜苷含量從高到低依次為85-5＞QH-1＞BX＞山東＞BJ-1＞金九，結果見表3。

表3 不同種質地黃中總環(huán)烯醚萜苷的含量測定結果

2.4.2 不同種質地黃中梓醇的含量測定 取18批地黃樣品按“2.2”項下方法測定梓醇的含量。結果顯示，6種種質地黃中梓醇含量最高的是BX地黃，其次是山東地黃、金九地黃，其余3種種質地黃中梓醇的含量差異不大。結果見表4。

表4 不同種質地黃中梓醇的含量測定結果

2.4.3 不同種質地黃中地黃苷D、地黃苷A、益母草苷的含量測定 取18批地黃樣品按“2.3”項下方法測定地黃苷D、地黃苷A、益母草苷的含量。結果顯示，6種種質地黃中地黃苷D、地黃苷A含量最高的是金九地黃，益母草苷含量最高的是BX地黃，具體見表5。

表5 不同種質地黃中地黃苷D、地黃苷A、益母草苷的含量測定結果

2.5 不同種質地黃的聚類分析

為了更直觀地分析不同種質地黃質量的差異性及相似性，筆者將其環(huán)烯醚萜苷類成分的含量測定結果經Origin 2019軟件歸一化處理后，繪制聚類熱圖（見圖3，顏色由紅到綠表示地黃中該成分含量越高）。結果顯示，6種種質地黃可聚為4類：金九地黃聚為一類，特征為地黃苷D、地黃苷A含量較高；BX地黃聚為一類，特征為梓醇、益母草苷含量較高；山東、BJ-1地黃聚為一類，特征為益母草苷含量較高；QH-1、85-5地黃聚為一類，特征為總環(huán)烯醚萜苷量較高。其中，85-5、QH-1地黃中總環(huán)烯醚萜苷含量均明顯高于其他種質地黃，BX地黃中梓醇含量明顯高于其他種質地黃，金九地黃中地黃苷D、地黃苷A含量均明顯高于其他種質地黃，BX、山東、BJ-1地黃中益母草苷含量均明顯高于其他種質地黃。

圖3 不同種質地黃中環(huán)烯醚萜苷類成分含量的聚類熱圖

2.6 不同種質地黃的因子綜合分析

基于多成分多指標的因子綜合評價多元統(tǒng)計方法可以較為全面、客觀地反映藥材的真實質量[13]。本研究首先利用單因素方差分析獲得總環(huán)烯醚萜苷類成分在不同種質地黃中的重要程度（見表6）。結果顯示，不同種質地黃中總環(huán)烯醚萜苷類成分具有顯著性差異，說明種質對地黃總環(huán)烯醚萜苷類成分的含量有顯著影響。

表6 不同種質地黃中總環(huán)烯醚萜苷成分的單因素方差分析結果

其次，對不同種質地黃中總環(huán)烯醚萜苷、梓醇、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷的特征值及方差貢獻率進行綜合分析（見表7）。結果顯示，方差累計貢獻率達83.633%，特征值均大于1；提取到2個主成分，可基本表征地黃藥材的質量，其中第一公因子在變量地黃苷D、地黃苷A、益母草苷中有較大載荷，第二公因子在變量梓醇、總環(huán)烯醚萜苷中有較大載荷。以各公因子對應的方差貢獻率為權重計算各種質地黃的綜合得分[14]，來綜合評價不同種質地黃藥材的質量。結果顯示，BX、山東、85-5、BJ-1、QH-1、金九地黃綜合得分分別為2.283 9、1.689 1、1.664 8、1.503 3、1.469 0、1.214 6，說明不同種質地黃的質量存在差異。

表7 不同種質地黃主成分分析的特征值與方差貢獻率

2.7 不同種質地黃差異成分的篩選

為進一步篩選導致不同種質地黃質量差異的關鍵成分，筆者將其環(huán)烯醚萜苷類成分的含量測定結果作為變量值輸入到SIMCA 14.1軟件中，以變量重要性投影值大于1為篩選標準[15]，進行PLS-DA。結果顯示，總環(huán)烯醚萜苷、梓醇、益母草苷的變量重要性投影值均大于1，說明這3種成分可能是造成不同種質地黃質量差異的主要環(huán)烯醚萜苷成分。

3 討論

中藥具有復雜性、整體性等特征，單純的指標性成分含量測定并不能反映中藥的整體質量特征[5]，因此本研究在《中國藥典》規(guī)定的梓醇、地黃苷D等指標性成分基礎上，對地黃中總環(huán)烯醚萜苷、地黃苷A、益母草苷進行了測定。結果表明，不同種質地黃中環(huán)烯醚萜苷類成分含量存在一定的差異；進一步經聚類分析發(fā)現(xiàn)，金九地黃單獨聚為一類，BX地黃單獨聚為一類，山東、BJ-1地黃聚為一類，QH-1、85-5地黃聚為一類。

因子綜合分析結果顯示，上述5種成分均作為主成分信息來反映地黃的質量，但每種成分的貢獻度不同，地黃苷D、地黃苷A、益母草苷以第一主成分信息表征了不同種質地黃的化學質量差異，梓醇、總環(huán)烯醚萜苷以第二主成分信息表征了其化學質量差異。進一步以各公因子對應的方差貢獻率為權重計算各種質地黃的綜合得分，結果發(fā)現(xiàn)，綜合得分排名依次為BX＞山東＞85-5＞BJ-1＞QH-1＞金九。由此可見，不同種質地黃中環(huán)烯醚萜苷類成分的含量存在差異。為了篩選導致不同種質地黃質量差異的關鍵成分，筆者結合PLS-DA，以變量重要性投影值大于1篩選出總環(huán)烯醚萜苷、梓醇、益母草苷可能是造成不同種質地黃質量差異的主要環(huán)烯醚萜苷類成分。

綜上所述，不同種質地黃的質量差異可能是由總環(huán)烯醚萜苷、梓醇、益母草苷這3種成分造成的。