Lipocalin2真核表達載體的構建及在HK-2細胞中的表達

金立新 陳明

脂質運載蛋白2（Lipocalin2，也被稱作SIP24，24p3，或 NGAL）,Lipocalin家族的新成員，是新近報道的調控E-cad表達的重要因子[1]，在維持腎小球基底膜的正常代謝功能，促進胚胎間充質細胞向腎小管上皮細胞分化及哺乳動物近端腎單位發(fā)育過程中的間充質-上皮轉換過程中起重要作用。然而，Lipocalin2可否通過調節(jié)E-cad的表達而抑制TEMT過程，從而抑制腎小管間質纖維化值得進一步研究。我們根據基因文庫中Lipocalin2基因（登錄號BC033089）的cDNA序列設計引物，擴增Lipocalin2基因全編碼區(qū)，定向克隆入質粒pEGFP-C3 中，利用脂質體（Lipofectamine 2000 Reagent）介導，將重組質粒轉染入HK-2細胞中，為進一步研究Lipocalin2在人腎近曲小管上皮細胞轉分化的作用及機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1實驗材料 人腎近曲小管上皮細胞株（HK-2），來源于American Type Culture Collection （ATCC）由重慶醫(yī)科大學腎內科惠贈。限制性內切酶Bam H I、Xho I、T4 DNA 連 接 酶、DL2000DNA marker、pEGFP-C3載體、Lipofectamine 2000 Reagent均購自Invitrogen公司， 抗人Lipocalin2單抗購自R&D公司；RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、質粒抽提試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒、瓊脂粉、抗生素購自北京Tiangen公司；胰蛋白胨和酵母粉提取物為美國Gibco公司產品。大腸桿菌DH5a菌株（瀘州醫(yī)學院中心實驗室常規(guī)保存）。

1.2實驗方法

1.2.1lipocalin2基因的合成 根據已經報道的Lipocalin2基因的cDNA序列（基因文庫登錄號BC033089）設計引物，擴增Lipocalin2基因全編碼區(qū)，全長597bp。根據Lipocalin2基因和真核表達載體pEGFP-C3的基因序列、蛋白編碼框架及起始、終止密碼子的位置，選用Xho I 、Bam H I作為亞克隆時酶切位點，引物設計如下：

PCR擴增目的基因，電泳鑒定后，參照天根公司的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書收集DNA溶液，測定其濃度，保存-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2重組質粒構建及……