Lipocalin2真核表達載體的構建及在HK-2細胞中的表達

金立新 陳明

脂質運載蛋白2（Lipocalin2，也被稱作SIP24，24p3，或 NGAL）,Lipocalin家族的新成員，是新近報道的調控E-cad表達的重要因子[1]，在維持腎小球基底膜的正常代謝功能，促進胚胎間充質細胞向腎小管上皮細胞分化及哺乳動物近端腎單位發育過程中的間充質-上皮轉換過程中起重要作用。然而，Lipocalin2可否通過調節E-cad的表達而抑制TEMT過程，從而抑制腎小管間質纖維化值得進一步研究。我們根據基因文庫中Lipocalin2基因（登錄號BC033089）的cDNA序列設計引物，擴增Lipocalin2基因全編碼區，定向克隆入質粒pEGFP-C3 中，利用脂質體（Lipofectamine 2000 Reagent）介導，將重組質粒轉染入HK-2細胞中，為進一步研究Lipocalin2在人腎近曲小管上皮細胞轉分化的作用及機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1實驗材料 人腎近曲小管上皮細胞株（HK-2），來源于American Type Culture Collection （ATCC）由重慶醫科大學腎內科惠贈。限制性內切酶Bam H I、Xho I、T4 DNA 連 接 酶、DL2000DNA marker、pEGFP-C3載體、Lipofectamine 2000 Reagent均購自Invitrogen公司， 抗人Lipocalin2單抗購自R&D公司；RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、質粒抽提試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒、瓊脂粉、抗生素購自北京Tiangen公司；胰蛋白胨和酵母粉提取物為美國Gibco公司產品。大腸桿菌DH5a菌株（瀘州醫學院中心實驗室常規保存）。

1.2實驗方法

1.2.1lipocalin2基因的合成 根據已經報道的Lipocalin2基因的cDNA序列（基因文庫登錄號BC033089）設計引物，擴增Lipocalin2基因全編碼區，全長597bp。根據Lipocalin2基因和真核表達載體pEGFP-C3的基因序列、蛋白編碼框架及起始、終止密碼子的位置，選用Xho I 、Bam H I作為亞克隆時酶切位點，引物設計如下：

PCR擴增目的基因，電泳鑒定后，參照天根公司的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書收集DNA溶液，測定其濃度，保存-20℃備用。

1.2.2重組質粒構建及鑒定 將擴增的目的基因Lipocalin2和空載體pEGFP-C3質粒用Xho I和Bam H I進行雙酶切，取5μl行瓊脂糖凝膠電泳，用DNA凝膠純化試劑盒回收質粒載體后定量，按照目的基因∶載體為3∶1、T4DNA連接酶、10 x連接緩沖液，總反應體積為10μl，16℃連接過夜。再將連接產物轉化入感受態細胞擴增，參照天根質粒抽提試劑盒抽提質粒，Xho I和Bam H I雙酶切重組質粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并將陽性克隆提取質粒后送上海生工生物技術公司對重組質粒進行測序鑒定并將重組質粒命名為pEGFP-C3-Lipocalin2。

1.2.3重組質粒轉染HK-2細胞 選擇對數增長期生長狀態良好的HK-2細胞，胰酶消化細胞，以5×105個接種到6孔板中，24h后細胞長到60%～70%左右融合，進行轉染，按照脂質體試劑說明書操作，轉染后48h加入篩選抗生素G418（800ng/ml）持續培養14d后，挑出單克隆，擴大培養，同時設對照組細胞。

1.2.4RT-PCR檢測Lipocalin2 mRNA的表達 分別取轉染pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3的細胞，收集細胞，提取細胞總RNA（按RNA抽提試劑盒說明書操作），逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，PCR擴增Lipocalin2基因，10g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳成像系統分析。

1.2.5Western blotting檢測Lipocalin2 蛋白的表達 分別取轉染pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3的細胞，提取細胞總蛋白，同時加入蛋白酶抑制劑PMSF（100mg/L）和抗氧化劑β-巰基乙醇（1mg/L），蛋白樣品在100℃變性5min，用12ml/L聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣30μg。電泳后用電轉儀轉移到PVDF膜上，室溫下（洗好膜后）用5mg/L脫脂奶粉（DSM，in TBST），封閉 2h，分別一抗 4℃過夜 ,洗膜后加入二抗，室溫孵育2h，應用發光液（PIERCE）顯色，凝膠成像儀與Quangtity one軟件照相顯影。

2　結果

2.1Lipocalin2全序列PCR擴增后電泳鑒定Lipocalin2全序列PCR擴增產物10g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳成像系統分析，在597bp左右可見一條清晰的條帶，與DNA Maker相比，擴增產物大小與預測結果一致，見圖1。

圖1　Lipocalin2全序列電泳鑒定

2.2重組質粒pEGFP-C3-Lipocalin2的酶切鑒定重組質粒pEGFP-C3-Lipocalin2用限制性內切酶Xho I和Bam H I酶切后，10g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳成像系統分析，可見位于597bp和4700bp處的兩條清晰的條帶，與DNA Maker相比，產物大小與理論結果一致，見圖2。

圖2　重組質粒pEGFP-C3-Lipocalin2酶切鑒定

2.3重組質粒pEGFP-C3-Lipocalin2的測序鑒定測序結果經blast分析與基因文庫所提供序列一致，基因序列：ATGCCCCTAGGTCTCCTGTGGCTGGGC CTAGCCCTGTTGGGGGCTCTGCATGCCCAGGCCC AGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACC TCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAG GACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAG GCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAA AGACCCGCAGAAGATGTATGCCACCGTCTATGAG CTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCG TCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGAT CAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAG TTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGAT TAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAA CTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAA GTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCC TCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACT AAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGG GCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCA ATCGACCAGTGTATCGACGGCTAG，提示重組質粒pEGFP-C3-Lipocalin2構建成功。

2.4轉染pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP -C3的細胞的鑒定

2.4.1細胞形態學觀察 以488nm波長激發光激發，激光共聚焦顯微鏡下觀察，轉染pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3的細胞呈立方形或球形，具有典型的上皮細胞鋪路石樣特征，均發綠色熒光，轉染pEGFP-C3細胞熒光主要集中在細胞核，而轉染pEGFP-C3-Lipocalin2細胞熒光均勻分布在胞漿胞核，見圖3。

圖3　pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3在細胞中的表達

2.4.2Lipocalin2 mRNA表達檢測 PCR擴增產物10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統分析，穩定轉染pEGFP-C3-Lipocalin2、空載體pEGFP-C3細胞及對照組細胞在600bp左右均可見一條清晰的條帶，與DNA Maker相比，擴增產物大小與預測結果一致，且穩定轉染pEGFP-C3-Lipocalin2的細胞Lipocalin2 mRNA表達明顯高于空載體pEGFP-C3細胞及空白對照組細胞，初步提示穩定轉染pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3的細胞篩選成功，見圖4。

圖4　Lipocalin2基因電泳鑒定

2.4.3穩定轉染pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3細胞Lipocalin2蛋白表達檢測 Western blot結果顯示穩定轉染pEGFP-C3-Lipocalin2、空載pEGFP-C3細胞及空白對照組細胞在25KD左右均可見一條清晰的條帶，與蛋白Maker相比，產物大小與預期結果一致，且穩定轉染pEGFP-C3-Lipocalin2的細胞Lipocalin2蛋白表達明顯高于空載體pEGFP-C3的細胞，進一步提示穩定轉染pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3的細胞篩選成功，見圖5。

圖5　Lipocalin2蛋白表達鑒定

3　討論

Lipocalin2（也被稱做 NGAL/24p3）是 Kjeldsen等1993年在中性粒細胞中發現的一種脂質運載蛋白，廣泛分布于腎、支氣管、胃、小腸、胰腺等組織中，參與鐵及脂肪酸的轉運，促進凋亡的發生，抑制細菌的生長，參與炎癥趨化的調節。Jiang等[2]在研究中發現，Lipocalin2可以誘導乳腺癌細胞間充質-上皮轉分化，通過上調E-cad的表達使轉分化的乳腺腫瘤細胞恢復上皮細胞的形態，穩定上皮細胞的表型而抑制腫瘤細胞的遷移和擴散。Ratana等[3]發現Lipocalin2在上皮性卵巢腫瘤中明顯表達，而給予上皮生長因子誘導EMT使上皮性腫瘤向間質性腫瘤轉變過程中，Lipocalin2表達減少，且與成纖維細胞的標志—波形蛋白的表達相關，表明Lipocalin2參與維持了卵巢腫瘤的上皮表型。Ioannis等[4]在腎急性缺血-再灌注損傷模型過程中，局部缺血前、中、后期靜脈給予的重組Lipocalin2可顯著改善小鼠腎臟細胞的形態和功能，并可顯著減少小管細胞組織病理學損傷及降低血清肌酐水平，其機制可能如下：①Lipocalin2作為鐵轉運蛋白參與了損傷后腎小管上皮細胞內的鐵轉運和誘導血紅素加氧酶的生成，從而有利于損傷小管的再生；②Lipocalin2結合鐵而抑制E-cad磷酸化使E-cad降解減少[1]；③誘導腎小管-間質中浸潤的中性粒細胞發生凋亡以保護腎組織免受炎細胞的侵害；④誘導腎間充質細胞向腎小管上皮細胞的轉化，從而誘導腎小管上皮細胞的再生[1]。研究發現Lipocalin2參與了哺乳動物近端腎單位發育過程中的間充質-上皮轉換過程，而腎臟發育的基本特征就是間質細胞向上皮細胞轉化，Yang 等[5]分離小鼠的后腎間充質細胞和輸尿管芽，用純化的、有活性的輸尿管芽處理后腎間充質細胞，培養48h后，細胞中E-cad快速表達，2～4d后細胞出現上皮形態學改變，7～9d后形成腎小管和腎單位，進一步研究發現輸尿管芽中促進胚胎間充質細胞向腎小管上皮細胞分化的物質就是Lipocalin2，表明Lipocalin2可通過促進E-cad的表達而促進胚胎間充質細胞向腎小管上皮細胞分化。最新研究發現，Lipocalin2不僅作為急性腎小管損傷的早期標志物[6，7]，在CKD中與腎臟損傷程度的關系日益受到重視[8～10]。但有關Lipocalin2在腎小管上皮細胞轉分化過程中的表達及意義，尚有待深入探討，含有Lipocalin 2基因的高表達的真核載體是深入研究的工作基礎。

本實驗選用的載體是pEGFP-C3，充分發揮了eGFP優點：熒光強度增強，穩定性增加，持續時間延長，能長期持續觀察目的基因在HK-2活細胞中的表達；同時以pEGFP-C3為載體所構建的重組質粒可以在大腸桿菌中擴增，可轉染入哺乳動物細胞中。在構建重組質粒時，采用的是定向克隆的方法，采用這種定向克隆構建重組質粒有以下優點：目的基因只以一個方向插入載體中，沒有了正、反篩選的問題；載體的兩個粘性末端不同，減少了載體自身環化的機率，故所得的陽性克隆多為重組質粒；保留了目的基因和載體兩端的限制性內切酶位點，有利于重組質粒的酶切鑒定。構建好的重組質粒經限制性酶切和測序均說明Lipocalin2基因已連接到載體pEGFP-C3上，重組質粒pEGFPC3-Lipocalin2構建成功為下一步實驗奠定了重要基礎。將外源性DNA導入細胞有瞬時轉染與穩定轉染兩種方法，DNA轉染后，轉入基因的表達可以在1～4d內檢測到，只有一部分細胞的DNA被轉運到細胞核內進行轉錄并最終輸出mRNA到細胞質進行蛋白合成，為了進行穩定表達，轉入的目的基因必須在宿主細胞染色體上穩定整合，故本實驗采用了穩定轉染的方法，使用Invitrogen公司生產的lipofectamine2000作為轉染試劑，將Lipocalin2基因導入HK-2細胞，G418篩選穩定表達Lipocalin2基因的細胞株。RT-PCR和Western blot結果顯示pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3被成功轉染入HK-2細胞中并表達，為下一步實驗奠定了基礎。