川芎嗪注射液對缺氧狀態下視網膜血管內皮細胞增殖作用的影響

吳沂旎，吳寧玲，莊曾淵，郝進

近年來研究認為[1]，由于各種原因引起的缺血性眼底病變，與視網膜血管內皮細胞 （retina vascular endothelial cell,RVEC）受損及繼發出現的血管活性因子失衡有關，保護RVEC免受損傷是防治這類疾病的新途徑。川芎嗪具有活血化瘀、擴張血管、改善微循環、抗血小板聚集等作用，已被廣泛應用于青光眼[2]、缺血性視神經病變[3]、視網膜靜脈阻塞、糖尿病視網膜病變[4]等眼病，但因為關于川芎嗪對RVEC作用的研究甚少，有關該藥對RVEC的保護作用尚不明確。本文以缺氧狀態下培養的牛視網膜血管內皮細胞為對象，觀察了不同濃度川芎嗪對其生長、增殖的影響，現報告如下。

1　材料與方法

1.1　藥物與試劑

DMEM培養基（美國 Gibco），牛源內皮細胞生長因子（購于中日友好醫院細胞實驗室），胎牛血清（美國 Gibco），磷酸川芎嗪注射液（規格：50mg，瑞陽制藥有限公司），谷氨酰胺、雙抗、肝素、MTT（四甲基偶氮唑鹽），牛視網膜血管內皮原代細胞（購于北京中日友好醫院細胞庫）。ELX808酶標儀 （美國Bio-Tek公司產品）；倒置顯微鏡 （日本Olympus公司）

1.2　實驗方法

1.2.1細胞培養：將購買的牛視網膜血管內皮細胞(RVECs)原代細胞進行復蘇，取出內皮細胞凍存管迅速置于38℃水浴鍋中，使其快速融化，將細胞懸濁液移入離心管中，離心后并加入DMEM完全培養液[含 200 g/L FBS、100 mg/L內皮細胞生長添加劑（endothelial cell growth supplement,ECGS）、100mg/L肝素以及1 g/L雙抗]，并移入鋪滿明膠的75 ml培養瓶。置于5%CO2，37℃的培養箱中。第2天待細胞貼壁后換液。細胞生長旺盛，4～5 d可傳代1次，取第7～8代的細胞用于實驗。

1.2.2實驗分組：實驗分為3組。A.正常細胞對照組：用不含血清、生長因子的DMEM常規培養基培養。B.缺氧模型組：正常細胞對照組+終濃度1000 μmol/ml CoCl2。C.缺氧+不同濃度川芎嗪組：缺氧模型組+不同濃度的川芎嗪 （0.002、0.02、0.2、2 μg/ml，分別記作川芎嗪 1、2、3、4組）。

1.2.3川芎嗪對RVEC增殖影響的測定：制備第7代牛視網膜血管內皮細胞懸濁液，調節其密度為1×105個/ml，種于 96 孔培養板上，每孔種植 200 μl細胞懸液，在培養箱中培養24 h。細胞貼壁后，將細胞分成6組，每組5個平行孔，每孔200 μl培養液，培養24 h。實驗結束前4 h向每孔加入20 μl MTT，實驗結束后，小心棄去培養孔內的培養基，每孔加入二甲亞砜150 μl，在搖床上震蕩10 min混勻，待藍色結晶完全溶解后，用自動酶標儀（波長492 nm）測定各孔光密度[D(492 nm)]值。該值可間接反映活細胞數量，用以檢測細胞活性。另設各組細胞培養48 h后觀察，方法同上。實驗重復5次。以正常細胞對照組的細胞增殖率為100%，其他各組的細胞增殖率=[該組 D(492 nm)值/正常細胞對照組 D(492 nm)值]×100%。

1.2.4統計學處理

2　結果

2.1　細胞形態的變化

倒置相差顯微鏡觀察，正常細胞傳代4 h開始貼壁生長，融合成片，有的呈放射狀排列，活細胞透亮，呈梭形、多角形或橢圓形，相互之間連接緊密（圖1A）。在缺氧環境下，細胞數目明顯減少，細胞間隙增大，可見部分凋亡細胞（圖1B）。川芎嗪注射液作用24 h、48 h后的細胞培養液由橙紅色變成磚紅色，細胞形態有些變為短梭形，凋亡細胞數目明顯減少，細胞數量增多，成片融合，細胞緊密排列，呈典型的鋪路卵石樣結構（圖1C、1D）。

2.2　川芎嗪對細胞生長的影響

圖1　倒置相差顯微鏡觀察各組牛視網膜血管內皮細胞生長情況。1A.正常細胞傳代4 h開始貼壁生長，有的呈放射狀排列，活細胞透亮，呈梭形，相互之間連接緊密；1B.在缺氧環境下，細胞數目明顯減少，細胞間隙增大，可見部分凋亡細胞；1C.川芎嗪注射液作用24 h后細胞形態有些變為短梭形，凋亡細胞數目明顯減少，細胞數量增多，細胞緊密排列；1D.（48h 川芎嗪 0.2μg/ml）基本同 1C。

缺氧模型及藥物組各時間點的光密度值均較正常細胞對照組低（P＜0.01），加入 0.002 μg/ml川芎嗪后未見明顯變化，與缺氧模型組接近（P＞0.05）；當濃度增加至0.02、0.2 μg/ml時，細胞的光密度值開始明顯增加，高于缺氧模型組（P＜0.01），以川芎嗪0.2 μg/ml組的數值最高，但仍低于正常細胞對照組（P＜0.05）；濃度增加至 2 μg/ml時，其光密度值下降，推測該濃度可能出現了藥物毒性作用而抑制細胞增長。各組不同時間點的平均光密度及細胞增值率見表1。

表1　MTT法測定川芎嗪注射液對缺氧狀態下RVEC增殖的影響（ˉ±s，n=6）

表1　MTT法測定川芎嗪注射液對缺氧狀態下RVEC增殖的影響（ˉ±s，n=6）

注：*LSD 方法兩兩比較，與正常細胞對照組比較，24h：P（缺氧組）=0.000；P（0.002 組）=0.000；P（0.02組）=0.000；P（0.2組）=0.003；P（2 組）=0.000；48h*P（缺氧組）=0.000；P（0.002 組）=0.000；P（0.02 組）=0.000；P（0.2 組）=0.043；P（2 組）=0.000。#LSD 方法兩兩比較，與缺氧模型組比較，24h：P（0.002組）=0.105；P（0.02組）=0.000；P（0.2組）=0.000；P（2 組）=0.153；48h：P（0.002 組）=0.082；P（0.02 組）=0.000；P（0.2組）=0.000；P（2組）=0.296。 MTT：四甲基偶氮唑鹽;RVEC：視網膜血管內皮細胞

組別　D(492 nm)培養24 h　培養48 h正常細胞對照組缺氧模型組川芎嗪 1 組（0.002μg/ml）川芎嗪 2 組（0.02μg/ml）川芎嗪 3 組（0.20μg/ml）川芎嗪 4 組（2.00μg/ml）0.426±0.114 0.256±0.011*0.282±0.109*#0.364±0.015*#0.410±0.010*#0.264±0.011*#F值P值0.460±0.021 0.274±0.005*0.290±0.007*#0.376±0.008*#0.428±0.019*#0.288±0.019*#142.3 0.000 205.9 0.000

3　討論

視網膜血管內皮細胞受損是引起因各種缺血性眼底病變病理性變化的始動因素。血管內皮細胞構成了血管的光滑內襯，便于血液流動，并具備復雜的酶系統，能合成與分泌多種生物活性物質，這些血管活血物質當中，最為經典的是一氧化氮（nitric oxide,NO）及內皮素-1（endothelin-1,ET-1）。NO 和 ET-1 的變化是反映血管內皮細胞損傷最確切、最直接的標志[5]。生理情況下ET-1具有強烈收縮血管作用，可導致血流緩慢，促使血栓形成，而NO具有抑制血管內皮素分泌，擴張血管及調節平滑肌細胞增殖的作用，并能抑制血小板凝集、黏附及抑制白細胞黏附。NO和ET-1協調平衡，維持著血管外周阻力和局部血管的舒縮狀態，調節著視網膜的血液循環。缺氧是許多血管疾病中常見的病理現象，可在多個方面造成血管內皮細胞的損傷[6]，導致NO釋放減少和ET-1增加，血管舒縮功能失調、血小板凝聚，加速血栓形成，促使眼底病變進展。因此，尋找有效保護視網膜血管內皮細胞（RVEC）的藥物對于防治缺血性眼底病變具有重要意義。

川芎嗪又名四甲基吡嗪，是中藥川芎的提取物，具有抑制環核苷酸磷酸二脂酶的活性，可提高血小板中環腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）含量，降低血小板表面活性，從而抑制血小板聚集，防止血栓形成，并有輕度的溶解作用[7]。已有研究報道川芎嗪能保護在缺氧環境下受損的人臍靜脈內皮細胞，調節其分泌功能和血管舒縮功能，致ET水平明顯下降，NO水平明顯上升[8]，并能使血漿中氧自由基引起脂質過氧化反應的代謝產物MDA下降，使氧自由基清除劑SOD的活性升高。另有研究表明川芎嗪對視網膜缺血再灌注損傷具有保護作用，可減少缺血后視網膜細胞的凋亡[9]，清除氧自由基，對抗視網膜缺血再灌注損傷所介導的氧化反應，以及有效穩定細胞膜、降低脂質過氧化產物[10]。而對于川芎嗪是否能促進缺氧狀態下視網膜內皮細胞的增殖，國內外尚未見報道。

本實驗中，我們采用MTT法檢測缺氧狀態下不同濃度川芎嗪對RVEC生長的影響，結果發現川芎嗪0.02、0.2 μg/ml組的光密度值較缺氧組明顯升高，且后者的數值更高，提示在一定濃度范圍內川芎嗪對缺氧狀態下培養的RVEC具有促增殖作用，并存在一定的劑量-效應關系，這可能是其保護RVEC及RVEC功能的機制之一。當濃度升高至2 μg/ml時測量到的光密度值反而下降，推測可能在此濃度時出現藥物的毒性作用，抑制細胞增長。

本研究結果顯示，川芎嗪可抑制缺氧引起的RVEC活性降低，對細胞的增殖有一定的促進作用，推測該藥能在一定程度上阻斷內皮細胞受損導致的一系列病理變化，進而減輕眼部的病理改變，發揮對RVEC的保護作用。目前有關川芎嗪對眼科疾病作用機制的實驗研究不多，對于該藥在RVEC保護作用等方面的深入探索，不僅能為川芎嗪治療視網膜靜脈阻塞等缺血性眼底病變提供重要的藥理學依據，也有助于其在眼科領域發揮更大的作用。