清熱除濕湯煎藥機(jī)標(biāo)準(zhǔn)化煎藥流程的建立

王金鋼 李照福* 王宏蕾 馬 園

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 100010）

清熱除濕湯是我院皮科經(jīng)典常用方劑，具有清利濕熱，解毒涼血的功效，在臨床治療中應(yīng)用廣泛、療效顯著，受到了醫(yī)師和患者的推崇。為方便患者攜帶與服用，我院推出利用中藥煎煮機(jī)煎煮的湯劑以供患者選擇服用。中藥湯劑的煎煮工藝對(duì)方劑的質(zhì)量和療效發(fā)揮都具有重要作用，盡管清熱除濕湯應(yīng)用時(shí)間較長(zhǎng)，療效明確，但目前并沒(méi)有文獻(xiàn)對(duì)中藥煎煮機(jī)煎煮清熱除濕湯質(zhì)量進(jìn)行報(bào)道，為了保證清熱除濕湯代煎湯劑質(zhì)量穩(wěn)定可控，更好的發(fā)揮臨床療效，本著節(jié)能環(huán)保的目的，本試驗(yàn)選取龍膽苦苷[1]、黃芩苷和湯劑浸出物含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選法確定清熱除濕湯的最佳煎煮工藝，為規(guī)范我院中藥煎煮機(jī)煎煮清熱除濕湯提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試驗(yàn)儀器：HPLC儀（安捷倫-1100），天平（METTLER TOLEDO-XS205 DualRange），離心機(jī)（GT10-1）。

1.2 試驗(yàn)材料：龍膽苦苷對(duì)照品（批號(hào)：110770-201314），龍膽草（批號(hào)：13030701），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-200514），中國(guó)食品藥品檢定研究院，黃芩（批號(hào)：13080402），中國(guó)食品藥品檢定研究院，甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果[2]

2.1 色譜條件：色譜柱：Kromasi 100-5C18（250 mm×4.6 mm）；龍膽苦苷流動(dòng)相：甲醇-水（30∶70），流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，進(jìn)樣量：10 μL；黃芩苷流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（45∶55∶0.2），流速1.0 mL/min，柱溫：25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3000。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：分別精密稱取干燥恒重的龍膽苦苷對(duì)照品0.00159 g置于25 mL的容量瓶和黃芩苷對(duì)照品0.00054 g置于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.0636 mg/mL的龍膽苦苷對(duì)照品溶液和0.054 mg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液：精密量取5 mL 清熱除濕湯湯劑置于25 mL容量瓶中，加水定容至25 mL，搖勻，精密量取5 mL置離心管內(nèi)，緩慢加入甲醇5 mL，搖勻，靜置30 min，離心（6000 r/min，5 min），取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液：分別精密稱生地黃、板藍(lán)根、白茅根、車前草、茯苓、生石膏制備煎液，按照2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：分別精密吸取龍膽苦苷和黃芩苷的陰性對(duì)照溶液、供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，在1.1色譜條件下，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。可見(jiàn)龍膽苦苷保留時(shí)間為12.031 min，黃芩苷保留時(shí)間為27.832 min，供試品色譜圖中龍膽苦苷、黃芩苷色譜峰分別與前后色譜峰分離良好，且陰性無(wú)干擾，表明系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

圖1 不同溶液的HPLC圖

2.6 線性關(guān)系考察：分別精密吸取對(duì)照品溶液1、3、5、7、10、13、15、17 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程，龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=86.579X-2.8383，R=0.999（公式：A=1443869.6M+7782.6，r=0.999）。結(jié)果表明，在0.0636～1.0812 μg范圍內(nèi)，龍膽苦苷峰面積值與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系；黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=115.74X-9.8585，R2=0.999，結(jié)果表明，在0.2701～0.9359 μg范圍內(nèi)，黃芩苷峰面積值與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)：按擬定的色譜條件取供試品溶液10 μL，測(cè)定龍膽苦苷和黃芩苷的峰面積，重復(fù)5次。結(jié)果，龍膽苦苷RSD =1.03%；黃芩苷RSD=1.23%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取配制好的供試品溶液，按擬定色譜條件，分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積值。結(jié)果，龍膽苦苷RSD=1.54%，；黃芩苷RSD=0.67%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)：按擬定的含量測(cè)定方法，取同一批樣品溶液，分別制備5份供試品溶液，測(cè)定龍膽苦苷的含量，結(jié)果RSD為1.89%；測(cè)定黃芩苷的含量，結(jié)果RSD為0.87%，表明本品重現(xiàn)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)：取已知含量的供試品，各6份，每份10 mL，精密量取5 mL，置10 mL 量瓶中，加入濃度為0.0636 mg/mL的龍膽苦苷和濃度為0.054 mg/mL的黃芩苷對(duì)照品各5 mL，放置1 h，同時(shí)振搖，用微孔濾膜（0.45 μm）過(guò)濾，按2.1色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，龍膽苦苷為96.17%，RSD1.94%；黃芩苷為96.33%，RSD2.21%。見(jiàn)表2、3。

表6 正交試驗(yàn)及結(jié)果

表2 龍膽苦苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（μg）

表3 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（μg）

2.11 樣品含量的測(cè)定：取樣品，按擬定方法測(cè)定樣品中龍膽苦苷和黃芩苷的含量，測(cè)定結(jié)果為見(jiàn)表4（n=2）。

表4 龍膽苦苷、黃芩苷樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 清熱除濕湯煎煮的正交試驗(yàn)[3]

3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：以龍膽苦苷、黃芩苷2種成分為指標(biāo)，選取浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間因素，進(jìn)行了兩因素、三水平正交試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表5。

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

3.2 正交試驗(yàn)及其結(jié)果：根據(jù)“2.3”項(xiàng)下的樣品制備方法，分別按表5中的9組條件進(jìn)行正交試驗(yàn)，制備9組藥品每組平行3份，并在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣分析，測(cè)定指定的2種有效成分的含量。同時(shí)按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015版）附錄中干浸膏測(cè)定法（補(bǔ)充），測(cè)定浸出物含量，計(jì)算平均值。結(jié)果見(jiàn)表6。

由正交實(shí)驗(yàn)中的2種有效成分分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合浸出物結(jié)果共3項(xiàng)考察指標(biāo)，因此選用綜合加權(quán)評(píng)分法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。設(shè)定滿分為100分，其中浸出物含量能夠反應(yīng)全方位質(zhì)量，故權(quán)重系數(shù)為40，龍膽苦苷、黃芩苷此2種有效成分權(quán)重系數(shù)分別是30，綜合以上數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合加權(quán)評(píng)分，將得分結(jié)果帶入到正交試驗(yàn)表中，見(jiàn)表7。

根據(jù)表6結(jié)果用正交試驗(yàn)助手進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表7。分析結(jié)果表明，浸泡時(shí)間這個(gè)因素的F值為5.599，P值＜0.05；煎煮時(shí)間這個(gè)因素的F值為5.872，P值＜0.05，每個(gè)因素自身?xiàng)l件下都存在顯著差異。浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間2個(gè)因素?zé)o顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表7 方差分析表

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果分析，綜合極差和方差分析，同時(shí)考慮到具體工作中煎藥的可操作性，確定清熱除濕湯的最佳煎煮機(jī)煎煮工藝為A3B2，即浸泡60 min，煎煮45 min。

4 討 論

不同藥味、不同劑量組成的處方，其浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間都有所不同。必須根據(jù)藥物的性質(zhì)，劑量進(jìn)行優(yōu)化選擇。《傷寒論》中張仲景根據(jù)不同的方劑，運(yùn)用多樣的煎煮方法以取得好的臨床療效[4]。由此可見(jiàn)，煎藥質(zhì)量關(guān)乎著醫(yī)師治病的治療效果，因此需要科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、認(rèn)真的對(duì)待。

清熱除濕湯中君藥有龍膽草、黃芩等，研究表明，龍膽草中龍膽苦苷具有利膽、抗炎、健胃、降壓的藥理作用，黃芩中黃芩苷具抑菌、利尿、抗炎、降膽固醇、抗血栓形成、緩解哮喘、瀉火解毒、止血、安胎、抗變態(tài)反應(yīng)及解痙作用的藥理作用。因此本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)方法，以龍膽草中的龍膽苦苷，黃芩中的黃芩苷和浸出物含量為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，優(yōu)選了清熱除濕湯的最佳中藥煎煮機(jī)煎煮工藝組合A3B2，即清熱除濕湯浸泡60 min，煎煮45 min。

本研究采用正交試驗(yàn)法對(duì)清熱除濕湯的中藥煎煮機(jī)煎煮工藝參數(shù)進(jìn)行考察，希望以此對(duì)本院其他不同代煎處方的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考，并為代煎處方的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)范的起草提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。