LC—MS/MS法測定人血漿中多粘菌素E濃度分析方法的建立

張莉婷　周春娣　李建祥

【摘要】目的：建立人血漿中多粘菌素E濃度測定的LC-MS/MS方法，方法：樣品處理：蛋白沉淀；采用Agilent Polaris C18（50 * 3 mm， 3 μm）色譜柱；流動相05%甲酸水溶液（A）-05%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脫；流速為065 -24mL/min；內標物：多粘菌素B1；質譜檢測，正離子模式。結果：多粘菌素E1的線性范圍是200～2000 ng/mL（r2=09984），定量下限為200 ng/mL。批內精密度≤42%，批間精密度≤37%；提取回收率在1003%-1135%之間，總體變異系數（%CV）為62%。本方法定量下限低，血漿前處理方法操作簡便，節約成本。結論：建立的方法準確精密、穩定可靠，可用于人血漿中多粘菌素E1濃度的檢測。

【關鍵詞】 多粘菌素E；LC-MS/MS；蛋白沉淀

【中圖分類號】

R764.04【文獻標志碼】

B【文章編號】1005-0019（2018）06-220-01

多粘菌素是從多粘桿菌培養液中分離出的一種含多種組分的堿性多肽類抗生素，其結構是由環狀多肽和脂肪酸結合而成，可分為多粘菌素A、B、C、D、E、K、M和P共8種。其中多粘菌素E在該類抗生素中毒副作用小，在臨床上應用較多[1]。多粘菌素E是一種由至少30種不同的成分組成的復雜混合物[2]，其主要成分是多粘菌素E1（colistin A）和少量多粘菌素E2（colistin B）。多粘菌素E對革蘭氏陰性菌引起的感染有較強作用，抗菌譜主要為大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌、嗜血桿菌和銅綠假單胞菌等病原菌，并且這些細菌對氨基糖苷類，β內酰胺類和氟喹諾酮類等常用抗菌藥物的耐藥性相當普遍，許多菌更是多重耐藥[3]，但是多粘菌素E不易產生耐藥性。上世紀70年代多粘菌素因其腎毒性和神經毒性一度被棄用，然而多重耐藥革蘭氏陰性菌的出現促使多粘菌素重新成為人們治療革蘭氏陰性菌的重要選擇，再度被應用于臨床[4]，EVANS等人為：多粘菌素E是治療多重耐藥性革蘭氏陰性菌感染重要而又有效的手段[5]。目前對多粘菌素E的分析方法主要有HPLC法，MECC法和LC-MS/MS法，由于多粘菌素E的紫外吸收低，因而應用傳統HPLC法（紫外檢測器）分析對檢測器靈敏度要求較高。LC-MS/MS法廣泛應用于多粘菌素E的藥代動力學、臨床檢測等領域，在藥動學研究中使用該方法需要選擇較好的生物樣品前處理方法，本研究采用蛋白沉淀樣品的前處理方式，建立了血漿中多粘菌素E的LC-MS/MS檢測方法，簡化了血漿預處理過程，對色譜條件進行優化，為人血漿樣品中多粘菌素E濃度的測定提供了更簡便易操作和節約成本的方法。

1儀器與材料

11儀器質譜儀API5000（美國Applied Biosystem公司）；島津高效液相色譜（DGU-20A5在線真空脫氣機；LC-20AD液相泵；SIL-20ACXR自動進樣器；CBM-20A控制器構成，日本島津公司）；微量分析天平（XP6，梅特勒-托利多）；高速臺式冷凍離心機（5810R，eppendorf）；渦旋震蕩儀（M37610-33CN，Thermo）；超純水系統（Millipore）

12材料多粘菌素E標準品（批號1304FP0708 ，Sigma）；多粘菌素B1標準品（內標，批號：0248069-6，Cayman）；甲酸（色譜純，sigma）；乙腈（色譜純，sigma）；甲醇（色譜純，sigma）；去離子水（Millipore）

2方法

21色譜條件色譜柱Agilent Polaris C18（50 * 3 mm， 3 μm）；流動相：流動相A為05%甲酸水溶液，流動相B為05%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫見下表；進樣量10μL。

22質譜條件ESI：正離子模式；噴霧電壓：2000V；去簇電壓：90V；碰撞能量：45V；多粘菌素E1離子對5856→1011；多粘菌素B1離子對6025→2413

23血漿樣品處理移取100 μL 血漿樣品于96深孔板中，加入100 μL稀釋液至樣品中，加入50 μL 濃度為3000ng/mL 的內標工作液，加入400μL純水，渦旋使之混勻，加入400μL甲醇，800轉渦旋約1分鐘，于每分鐘3500轉，室溫下離心10分鐘，移取400μL純水于新的96孔板中，轉移200μL上清液至該96孔板中，封板后1000轉渦旋約1分鐘，于每分鐘3500轉，室溫下離心5分鐘，取上清液100μL進樣分析。

24線性范圍使用不同濃度的標準曲線工作溶液與空白血漿配制出濃度分別為200、400、100、200、400、800、1600和2000 ng/mL的多粘菌素E1血漿樣品，按照23項下處理，進樣分析，以多粘菌素E1在血漿中的濃度為橫坐標（X），以測得到的多粘菌素E1與內標的面積比為縱坐標（y），使用線性最小二乘法回歸計算（權重為1/x2），得到定量的線性范圍。

25定量下限使用最低濃度的標準曲線工作溶液與空白血漿配制成濃度為200ng/mL的定量下限樣品，平行配制6份，按照23項下處理，進樣分析，得到最低定量值。

26選擇性取6個不同批次未混合的空白人血漿， 除不加內標外，其余按“23”項下處理，進樣分析，得到空白血漿樣品色譜圖與定量下限色譜圖對比以考察選擇性。

27準確度和精密度使用不同濃度的質控工作溶液與空白血漿配制成定量下限、低、中、高4個QC濃度（200、600、300和1500ng/mL）的質控樣品，每個濃度有6個重復的樣品，按照23項下處理，測定3個獨立分析批（與標準曲線同時進行），得到批內和批間準確度和精密度。

28基質效應分別取6個不同批次的空白人血漿，每個批次配制一份，除不加內標外，按照23項下處理，最終分別加入與處理后的低濃度（600 ng/mL）、中濃度（300 ng/mL）和高濃度（1500 ng/mL）質控樣品濃度相當的標準品以及內標溶液進行分析。同時配制無基質存在的與低、中、高濃度質控樣品濃度相當的純溶液，平行三份，進樣分析。用有基質存在的樣品中分析物與內標物峰面積比值與純溶液中分析物與內標的平均峰面積比值相除來計算內標歸一化的基質效應因子。

29提取回收率3個濃度水平（600、300和1500 ng/mL）的基質樣品分別平行配制六份，除不加入內標溶液外，按照23項下處理，最終稀釋前，加入合適的內標溶液，確保其濃度與低濃度，中濃度和高濃度質控樣品提取后濃度相同。同時配制回收率參比樣品，提取過程與上述相同，但是分析物和內標溶液均在提取后，最終稀釋前加入。用常規提取樣品中分析物與內標的峰面積比值與回收率參比樣品中分析物與內標峰面積比值相除來計算多粘菌素E1在不同濃度水平的回收率。

210殘留評價在標準曲線定量上限樣品進樣后進一針空白基質樣品，通過比較空白基質樣品中分析物和內標物峰面積與定量下限樣品平均峰面積來評價本方法的殘留。

211人血漿短期穩定性分別將低（600 ng/mL）、高（1500 ng/mL）兩個濃度的人血漿質控樣品放置濕冰條件下（4h至24h），隨新鮮配制的標準曲線樣品一同測定，每個濃度水平平行測定6份。

212人血漿凍融穩定性分別將低（600 ng/mL）、高（1500 ng/mL）兩個濃度的人血漿質控樣品經過4次凍融循環（-70℃，濕冰上融化）后隨新鮮配制的標準曲線樣品一同測定，每個濃度水平平行測定6份。

3結果

31線性范圍與定量下限多粘菌素E1在人血漿中線性范圍為200～2000 ng/mL。直線回歸方程為y=0002931x-0004906， 加權因子為（1/x2），r2為09984，最低定量下限為200 ng/mL。

32選擇性在6個不同批次的空白人血漿樣品，與定量下限樣品（如圖1所示）對比，在多粘菌素E1和內標物保留時間處都沒有觀察到色譜峰信號（如圖2所示）表明本方法測定人血漿中多黏菌素E1的選擇性良好，血漿基質對測定無干擾。

33準確度和精密度多粘菌素E1在人血漿中每一濃度水平多黏菌素E1質控樣品的批內準確度在±81%以內，批內精密度≤42%，所有濃度水平的批間準確度在±65%以內，批間精密度≤37%。均符合接受標準。

34基質效應結果如表1-1所示，多粘菌素E1在人血漿中，在所有濃度水平內標歸一化的基質效應因子為098～102，精密度≤39%，符合基質效應的考察標準。

35提取回收率在所有濃度水平使用本提取方法，結果如表1-2所示，多粘菌素E1在人血漿中的平均回收率在1003%-1135%之間，總體回收率為1062%

36殘留評價分析物的進樣殘留峰面積在定量下限樣品峰面積的03%以內，且內標的進樣殘留峰面積在可接受分析批標曲樣品和質控樣品平均內標峰面積的00%以內，表明以本方法測定人血漿中多黏菌素E1高濃度樣品進樣后在系統中無明顯殘留，對于后續低濃度樣品的測定無影響，樣品分析時對樣品排放順序沒有要求。

37人血漿短期穩定性將樣品放置在濕冰條件下18小時后進樣分析，結果如表1-3所示，表明多粘菌素E1在該基質中濕冰上放置18小時穩定。

38人血漿凍融穩定性樣品經過4次凍融（-70℃，濕冰上融化）循環后，以新鮮制備的標準曲線測定，結果如表1-3所示，表明多黏菌素E1血漿樣品可穩定至少4次凍融循環。

4討論

在高效液相色譜法中，由于缺乏有效的發色團，多粘菌素E的紫外吸收非常弱又沒有熒光，在樣品分析時直接采用傳統技術（紫外檢測器）是不能得到一個高靈敏度的定量結果的[6]，因此如果使用HPLC對多粘菌素進行分析，就需要其他檢測器如蒸發光散射檢測器及熒光檢測器，或是對樣品進行柱前衍生化處理，來得到一個較好的響應值。Jian Lia[7]等采用氯甲酸（9-芴甲基）酯進行柱前衍生化，用熒光檢測器-高效液相色譜法測定人血漿中多粘菌素E的含量，可得到穩定的衍生物，結果選擇性好，靈敏度高，但是卻有柱前衍生化耗時且保留時間太長的缺點。近年來，高效液相色譜-串聯質譜法因其靈敏度高，可獲得較低的定量限，線性范圍較寬而被廣泛應用于生物制品中多粘菌素E的分析，但需要有較好的前處理技術（尤其生物制品）、干凈的流動相系統，良好的操作技術要求，用以保護質譜，延長使用壽命[6]，Zheng Ma[8]等采用固相萃取技術對生物樣品進行預處理，使用LC/MS-MS法檢測人血漿，尿液和其他生物制品中多粘菌素E1的含量，固相萃取技術可除去生物樣品中的內源性雜質，得到較干凈的樣品用于分析，但是固相萃取板價格昂貴，使得實驗成本大大提高。超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC/MS-MS）由于其分析時間短，靈敏度高，近年來也被常用于多粘菌素E藥動學研究，Miao Zhao[9]等采用弱離子交換固相萃取板對樣品進行前處理，開發并驗證了UPLC/MS-MS法檢測人血漿和尿液中多粘菌素的含量的方法。Giuliana Cangemi[10]等采用蛋白沉淀的前處理方式開發了UPLC/MS-MS法檢測人血漿中多粘菌素E含量的方法。

本文建立了高效液相色譜-串聯質譜法檢測人血漿中多粘菌素E1的生物分析方法。樣品經甲醇沉淀蛋白，取上清液分析，結果表明，多粘菌素E1的線性范圍是200～2000 ng/mL，定量下限為200 ng/mL，而有文獻報道為28 ng/mL甚至更高[8]，因此本方法定量下限更低；在人血漿中多粘菌素E1的提取回收率在1003%～1135%之間，批內批間精密度均不大于42%；多粘菌素E1血漿樣品可在濕冰中穩定至少18小時，可穩定至少4次凍融循環。本研究優化了高效液相色譜、質譜條件，同時采用了最為優化的蛋白沉淀提取方式，與固相萃取等前處理方法相比，操作簡便易行，技術難度低，準確度高，穩定性良好，同時又節約成本，經方法學驗證，本研究所建立的LC-MS/MS方法具有選擇性，準確性，精密性，且穩定可靠，符合相關規定，可用于大量人血漿樣品中多粘菌素E1的分析。

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