響應面法優化前包被屎腸球菌超聲計數條件的研究

劉　瓊，王海燕，贠婷婷*，孫　敏，潘　蕊

（1.思科福（北京）生物科技有限公司，北京 100081；2.北京挑戰生物技術有限公司，北京 100081）

發酵前包被微囊化培養屎腸球菌，即在發酵前將游離屎腸球菌菌體利用微囊化技術包裹在囊中，之后進行發酵培養（王婷婷等，2009），其與游離培養的屎腸球菌相比，菌株具有更快的生長優勢，有效提高了菌株對高銅及胃腸液的耐受性，對微生物菌株起到了很好的保護作用，保證其生理功能的發揮，解決了益生菌作為飼料添加劑存在的效價不穩定的問題（王婷婷等，2009）。但由于發酵前包被微囊化屎腸球菌菌體是包被到囊中以后發酵的，這就造成了囊中菌體密度過高，菌體之間緊密結合在一起，形成生物膜（Bartley等，2009），且不易分離，給后期通過稀釋涂布菌落計數的方法檢測相關產品中的活菌數帶來很大困難，為其相關產品的推廣使用帶來阻礙。

目前對前包被屎腸球菌產品的活菌計數主要采用振蕩法，即通過旋渦振蕩器振蕩對菌團產生垂直的剪切力將其打開，但此方法受操作人員振蕩的力度、角度及時間的影響較大，使得檢測的活菌數結果差異較大，且耗時耗力，對設備損壞也較為嚴重。因此，減少人為誤差，降低檢測成本，本文結合振蕩法，使用超聲清洗器，借助超聲產生的空化作用將菌團打開（劉媛麗等，2017），通過響應面法對超聲計數條件進行優化，探究一種檢出率較高、較穩定的前包被屎腸球菌相關產品的活菌檢測方法。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

1.1.1樣品來源前包被屎腸球菌產品由思科福（北京）生物科技有限公司提供。

1.1.2培養基膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂（北京路橋技術股份有限公司）。

1.1.3儀器與設備KQ-600KDE型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2　試驗方法

1.2.1樣品前處理準確稱取（10±0.02）g前包被屎腸球菌樣品于滅菌的錐形瓶中，在瓶中加入適量滅菌玻璃珠，加入90 mL滅菌破囊液，放入搖床 250 r/min，25℃ 處理 40 min，制成均液，備用。

1.2.2活菌計數方法參考國標GB4789.35-2016。

1.2.3單因素試驗取1 mL制備好的菌懸液，加入有9 mL無菌生理鹽水的試管中，在設定條件下（考察超聲功率、超聲試管數及不同稀釋梯度試管超聲時間）超聲處理，每支試管超聲前后均用旋渦振蕩器振蕩10 s（3000 r/min，25～30下），梯度稀釋至10-9，選取10-7、10-8和10-9三個稀釋梯度平板涂布，培養（37℃，24 h），計數（cfu/mL），平行3組。

1.2.4響應面分析根據單因素試驗篩選的原菌液稀釋10倍（10-1）的試管超聲時間、梯度稀釋100倍的試管超聲時間和超聲功率三因素三水平試驗，采用Design-Expert8.0.6軟件設計試驗條件，選用Box-Behnken模型，以菌落數（cfu/g）為響應值，做三因素三水平二次回歸正交組合試驗，以 X1（10-1超聲時間）、X2（10-2超聲時間）、X3（超聲功率）為自變量，以菌落數（cfu/g）為響應值（Y），進行響應面分析，每組平行3次，取平均值，優化前包被腸球菌超聲計數條件。

2　結果與分析

2.1　單因素試驗結果

2.1.1超聲功率試驗用超聲清洗器額定功率為600 W，可調功率為240～540 W。故試驗選取240、360 W和480 W三個梯度的超聲功率。

2.1.210-1超聲時間在超聲功率為240 W條件下，只對梯度稀釋的第一支試管即10-1進行超聲處理，不同超聲時間對前包被屎腸球菌活菌計數結果的影響如圖1所示。

從圖1中可以看出，在10-1超聲時間為5 min時計數結果最佳。隨著超聲時間的延長，活菌數減少，說明超聲過程中產生的熱量及空化作用可能會造成部分屎腸球菌菌體細胞的損傷甚至死亡（劉麗艷等，2012）。因此，10-1超聲時間選擇3、5 min和7 min進行之后的響應面優化試驗。

圖1　10-1超聲時間對活菌計數結果的影響

2.1.310-2超聲時間在超聲功率為240 W，10-1超聲5 min條件下，對梯度稀釋的第二支試管即10-2進行超聲處理，不同超聲時間對前包被屎腸球菌活菌計數結果的影響如圖2所示。

從圖2中可以看出，10-2在超聲60 s時，計數結果最佳。之后隨著超聲時間的延長，活菌數出現減少現象，這是由于超聲對試管內菌體造成的損害，且隨著稀釋倍數的增加，菌液中菌體密度大大減少，超聲對菌體的損害力度可能會增加，故10-2超聲時間選擇20、40、60 s進行響應面優化。

圖2　10-2超聲時間對活菌計數結果的影響

2.2響應面設計試驗結果及分析

2.2.1Box-Behnken設計實驗方案及試驗結果采用Design-Expert 8.0.6軟件設計試驗條件，選用Box-Behnken模型，對表1的結果進行多原線性回歸擬合，得到活菌數對10-1超聲 時 間 T1（A）、10-2超 聲 時 間 T2（B）、超 聲功率P（C）的二次多項式回歸方程模型：Y=5.99521A+0.53498B+0.11018C-0.020000AB-7.45833×10-3AC-3.80208×10-4BC-0.21740A2-3.78021×10-3B2-8.66030×10-5C2-41.06531

2.2.2響應面回歸模型方差分析為檢驗回歸方程的有效性，進一步確定各因素對前包被腸球菌活菌計數結果的影響，對回歸模型進行方差分析，結果見表2。

從表2中可以看出，模型P＜0.01，回歸影響顯著，即對計數結果影響顯著。失擬項P＞0.05，失擬不顯著，通過對試驗模型可信度進行分析，得到回歸系數R2=0.9550，方程擬合得很好，且該方程可很好描述試驗因素與響應值之間的關系，試驗方法可靠。從方程系數顯著性檢驗可看出，因素 A、C、AB、BC、A2、C2對應的 P值均大于0.01

表1　響應面分析方案及試驗結果

表2　響應面回歸模型方差分析

圖3～5直觀的反應了各因素對響應值Y的影響，給出各因素交互作用的響應面3D與等高線分析圖。從響應面的最高點和等高線可以看出，所選因素水平范圍內存在極值，即響應值的最高點。各試驗因素對響應值的影響關系為：A＞C＞B。

圖3　10-1和10-2超聲時間對活菌計數的等高線和響應面

圖4　10-1超聲時間和超聲功率對活菌計數的等高線和響應面

圖5　10-2超聲時間和超聲功率對活菌計數的等高線和響應面

2.2.3優化與驗證試驗根據所得模型，優化得到最佳計數條件為：A=7 min，B=39.8 s，C=247.37 W，活菌計數結果最佳為5.28×1011cfu/g。結合實驗用儀器及操作可行性，將優化得到的最佳方案修改為：10-1超聲7 min，10-2超聲45 s，超聲功率240 W。進行驗證試驗，得到活菌計數結果為5.53×1011cfu/g，響應面法優化得到的最佳計數條件可靠。

3　討論

本研究以前包被屎腸球菌為原料，借助超聲清洗器產生空化作用，采用超聲振蕩方法，通過MRS瓊脂平板涂布進行活菌計數。超聲空化即液體內的微小氣泡，在聲波的交變聲壓作用下進入振動狀態，當其振蕩頻率與聲波頻率接近時，進入共振狀態，使振動的幅度逐漸增大，在聲波的負壓半周期內迅速膨脹，爆破瞬間產生巨大力量（張偉等，2016；Miller等，2007）。借助超聲空化作用產生的巨大力量將前包被微膠囊中的結合緊密的菌團打開，從而盡可能多的檢測到囊中的活菌數，但超聲強度及隨著超聲時間的增加產生的熱量會對菌體造成損害，導致其失活死亡。有研究表明，功率1000 W超聲時間超過5 min會對一些細菌產生損害（吳曉玲等，2007），因此，需要選擇適當的強度和適當的超聲時間。從單因素試驗結果可以看到，隨著超聲時間的增加，通過平板涂布計數得到的活菌數呈先增加后減少的趨勢，說明合適的超聲時間有助于微膠囊中菌團的打開，但隨著時間不斷的增加及熱量的累積，會有大量菌體受到損傷。通過響應面法對超聲強度即功率、不同稀釋梯度試管的超聲時間進行優化得到較優方案，之后通過多組平行驗證實驗證明其可靠性。但不同菌體及不同實驗人員的操作存在差異，故此方法僅為之后相關產品的檢測提供參考，針對不同菌種及不同產品應適當做出調整。

4　結論

通過響應面法優化分析得到前包被屎腸球菌活菌超聲計數方法的最佳計數條件為超聲功率240 W、稀釋10倍的試管超聲7 min、稀釋100倍的試管超聲45 s，在此條件下，前包被屎腸球菌計數結果為5.53×1011cfu/g。較單因素計數結果得到了相應的提高，證明采用響應面法優化超聲計數條件可靠，為前包被微囊化益生菌相關產品活菌檢測方法提供指導，對前包被微囊化產品的活菌檢測方法研究具有重要意義。