水稻蛋白激酶基因啟動子OsSRLp的分離及特性分析

王慶國 王瑩瑩 李臻 潘教文 王一帆 李穎秀, 2 劉煒, 2,*

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水稻蛋白激酶基因啟動子OsSRLp的分離及特性分析

王慶國1王瑩瑩1李臻1潘教文1王一帆1李穎秀1, 2劉煒1, 2,*

(1山東省農業科學院 生物技術研究中心/山東省作物遺傳改良與生理生態重點實驗室, 濟南 250100;2山東師范大學 生命科學學院, 濟南 250100;*通訊聯系人, E-mail: wheiliu@163.com)

【目的】為研究水稻中I型酪蛋白激酶基因啟動子的結構及功能，【方法】以水稻中花11基因組DNA為模板，經PCR擴增獲得基因上游約1600 bp序列，命名為啟動子OsSRLp。應用PLACE在線軟件，分析序列中的順式作用元件，同時構建含有GUS報告基因的植物表達載體，轉化水稻。【結果】為組成型表達，OsSRLp含有調控生殖發育、激素應答及逆境響應等多種順式作用元件。OsSRLp驅動的GUS報告基因在根、莖中均有所表達，在小穗中表達豐度較高，而在其他組織中表達豐度較低。【結論】OsSRLp為組成型啟動子，其下游調控基因可能參與水稻發育及生殖過程。

水稻；啟動子OsSRLp；表達特性；GUS活性；發育及生殖

水稻主要通過根系吸收水分和養分，以滿足自身生長發育、新陳代謝等生理活動和蒸騰作用的需要，根系的發生及發育在其生長發育中具有重要作用。前期研究中，我們在水稻突變體庫中篩選到一個根系發育相關突變體，其初生根及不定根發育遲緩，根部長度短于對照。通過構建遺傳群體并進行基因定位，克隆了位于水稻第10染色體上編碼Ⅰ型酪蛋白激酶的基因(Os10g0476300)，并將該基因命名為()。已知Ⅰ型酪蛋白激酶在真核生物中廣泛存在，可參與多種細胞功能及發育過程的調節[1-3]。近年來，對Ⅰ型酪蛋白激酶功能的研究表明，該蛋白主要通過磷酸化作用，在水稻開花及穗發育、根部發育、植物胞間大分子運輸、激素響應等生物過程中發揮作用[4-5]。

啟動子對其下游基因在植物特定組織、發育階段以及不同環境下的表達具有重要的調控作用。以往的研究已經從植物病毒和植物中分別分離到組成型啟動子、組織專一性啟動子及誘導型啟動子[6]。其中，花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子、肌動蛋白(Actin)啟動子和泛素(Ubiquitin)啟動子等，具有調控下游基因長期、穩定、高效表達的特點，在研究中也得到廣泛應用[7]。啟動子的克隆和關鍵順式作用元件鑒定對研究基因表達調控具有重要意義，也可為進一步解析基因功能提供線索[8-9]。本研究參照數據庫中水稻基因組序列，獲得了基因上游約1600 bp的調控序列作為基因啟動子區。應用生物信息學的方法，對其中關鍵順式作用元件進行分析、歸類，并構建含有GUS報告基因的啟動子表達載體轉化水稻，經抗性篩選獲得轉基因株系。通過對水稻各組織進行GUS染色分析，對啟動子的表達調控及基因的表達模式進行分析、鑒定，旨在對解析啟動子的作用及表達調控規律，深入研究其下游基因的表達特性及生物學功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

以水稻品種中花11為試驗材料，種子經水培萌發后，置于人工氣候箱中，在(28±1)℃、12 h光照/12 h黑暗光周期下生長；采集生長至兩周的幼苗，經液氮速凍后于－70℃下保存，用于之后水稻基因組DNA的提取。在水稻營養生長及生殖生長的不同階段分別對各組織進行取樣，選取成熟的水稻種子，水稻幼苗期的根、幼葉，營養生長期的莖、葉片、葉鞘和灌漿期的小穗于－70℃下保存，用于之后各組織RNA的提取及反轉錄。

植物雙元表達載體pCAMBIA1300+pBI101、根癌農桿菌LBA4404均由本實驗室保存。各種限制性內切酶、DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶、反轉錄試劑盒等均購自TaKaRa公司；DNA標記、質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒均為Transgen公司產品(購自山東濟南雨同生物科技有限公司)；其余試劑為進口或國產分析純。引物由上海英濰捷基公司合成，序列測定由山東省農業科學院生物技術研究中心測序室完成。

圖1 植物雙元表達載體pOsSRLp的T-DNA區結構

Fig. 1. Structure of T-DNA region of binary vector of pOsSRLp.

1.2 基因OsSRL的表達模式分析

分別對保存于－70℃下的水稻材料，包括成熟種子、幼根、幼苗、莖、葉片、葉鞘和灌漿期的小穗提取RNA，之后各樣品分別取4mg進行反轉錄。反轉錄后的單鏈cDNA經分裝后，于－20℃下保存備用。參照序列，以引物OsSRL-RT1（5′-CAG GGAGAACAAGAATCTGAC-3'）及引物OsSRL- RT2(5'-CTTATTGGTAGAACCCATCTG-3')進行RT-PCR；以水稻為內標，引物為OsActin1(5′-GAACTGGTATGGTCAAGGCTG-3′)及OsActin2 (5′-ACACGGAGCTCGTTGTAGAAG-3′)。經對反轉錄產物定量后，以定量的第一鏈cDNA為模板進行PCR，體系30mL，94℃下5 min，之后94℃下30 s、56℃下30 s、72℃下1 min共35個循環，72℃下延伸10 min。檢測不同組織中基因表達情況。基因在各組織中的相對表達量進一步應用Image J 1.45S進行量化分析。

1.3 基因OsSRL啟動子區的分離

已知基因定位于水稻第10染色體上。利用基因序列在NCBI數據庫(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLASTN檢索，在基因序列上游選取約1600 bp片段設計特異性引物OsSRLp-1(5′-AAGCCATACCTCCAAACACACC-3′)和引物OsSRLp-2(5′-GTAAAACGGCGAATATCAAAGC- 3′)，以水稻中花11基因組DNA為模板，經PCR擴增，獲得啟動子OsSRLp片段。PCR程序如下：95℃下5 min、之后4℃下3 min、進一步經94℃下45 s、58℃下45 s、72℃下3 min，共35個循環，最后72℃下15 min。進一步應用PLACE軟件(http:// www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)對其中的轉錄調控元件進行分析。

1.4 OsSRLp表達載體的構建及水稻遺傳轉化

將經PCR獲得的啟動子OsSRLp片段正向與經Ⅰ酶切的質粒載體pCAMBIA1300+pBI101連接，獲得重組質粒pOsSRLp(圖1)。

將測序正確的植物表達載體pOsSRLp經液氮凍融法[10]導入根癌農桿菌菌株LBA4404感受態細胞中，進一步轉化水稻愈傷組織，經潮霉素抗性篩選，獲得轉基因陽性株系。

1.5 DNA提取及轉基因植株的PCR檢測

取經潮霉素抗性篩選獲得的再生水稻植株幼葉葉片，參照CTAB法[11]提取基因組DNA，取2 μL DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測濃度及純度。

應用啟動子OsSRLp上游引物OsSRLp-1及GUS報告基因的下游引物5′-AGACTTCGCGCT GATACCAG-3′進行PCR擴增，檢測、鑒定T0代轉基因陽性株系。收獲的種子經40 mg/L潮霉素抗性篩選，獲得T1代陽性株系。以T1代陽性植株為材料, 對所收獲的T2陽性植株的種子進行GUS 組織化學染色，分析啟動子的表達調控模式。

1.6 GUS組織化學染色

GUS染色參照Jefferson[12]的方法進行。分別對水稻萌發期的胚根、胚芽、莖、幼穗及灌漿成熟期的種子等材料進行染色分析。將各材料置于37℃下GUS染液中染色過夜，之后用75%的乙醇脫色至陰性對照為白色, 樣品于體視顯微鏡(LEICA S-系列)下觀察染色結果, 照相并記錄。

2 結果與分析

2.1 基因OsSRL啟動子區的分離

以中花11基因組DNA為模板，經特異引物的PCR擴增，獲得啟動子區片段OsSRLp(圖2)。

2.2 基因OsSRL在水稻各組織中的表達模式

利用RT-PCR的方法分析基因的表達模式(圖3)，發現在水稻成熟種子、幼苗期的根、幼葉、營養生長期的根、莖、葉、葉鞘和灌漿期的小穗中都有轉錄，且在根、莖及小穗中表達較強，在收獲后的成熟種子及營養生長期的葉鞘中也有表達，但在營養生長期的葉中表達較弱，整體表現為組成型表達(圖3-A)。基因在各組織中相對表達量分析顯示，其在水稻灌漿期的小穗中表達量較高，比收獲的成熟種子中基因的表達量高出近10倍；在根及莖中的表達量也較高，是收獲的成熟種子中基因表達量的近5倍，在其他各組織中的表達則相對較弱(圖3-B)。

2.3 啟動子OsSRLp中順式作用元件分析

應用PLACE數據庫，對啟動子OsSRLp中所包含的調控元件進行分析、檢索，獲得了部分已知功能的順式作用元件，其中包含基因上游的一個TATA盒，即RNA聚合酶結合位點之一，此元件的存在可保證基因轉錄的精確起始；基因上游還存在多個CAAT盒，可對基因轉錄頻率進行調控。此外，在OsSRLp中還存在多種與植物生殖發育、激素及環境響應相關的調控元件(表1)。

NNN示分離啟動子區的PCR引物OsSRLp-1和OsSRLp-2的核苷酸序列。

Fig. 2. DNA sequence of promoter OsSRLp.

圖3 OsSRL表達模式及其在組織中的相對轉錄水平

Fig. 3. The expression patterns ofand its relative transcription levels in different rice tissues.

這些調控元件中，主要包括參與種子及貯藏蛋白相關生物學過程的CANBNNAPA元件、EBOXBNNAPA元件以及DOFCOREZM元件，其中DOFCOREZM元件序列為AAAG，在OsSRLp中出現8次，主要通過參與碳代謝從而間接參與貯藏蛋白相關生物學過程；同時，還鑒定到部分在植物生長節律性調節、開花及花粉發育等生殖生長過程中起調控作用的順式作用元件，如CIACADIANLELHC、MYBPLANT、MYBPZM及MYBST1元件；部分具有響應生長素等植物激素及光信號的順式作用元件，如生長素響應元件CATATGGMSAUR、NTBBF1ARROLB，及部分參與光響應的作用元件如GT1CONSENSUS等，也存在于OsSRLp中。這些具有多種調控作用的順式作用元件的存在，顯示OsSRLp可參與調控多種生物過程，其所調控的下游功能基因，在植物生長發育及環境響應等多方面均具有一定的作用，尤其在光形態建成、花發育、生物節律性的維持、生長素響應及其信號轉導途徑、光調控的信號轉導等過程。

2.4 轉基因植株的鑒定及GUS組織化學染色

經潮霉素抗性篩選，獲得T1代轉基因株系，進一步應用啟動子OsSRLp特異性引物進行PCR鑒定，最終獲得6個轉基因陽性株系。

鑒定為陽性的T1代轉基因株系，收種后，經潮霉素抗性篩選獲得抗性苗，以之為材料，分別取種子萌發期的胚根、胚芽、抽穗揚花期的小穗及灌漿成熟期的種子進行GUS染色，分析其表達特性。

結果顯示，在水稻種子的萌發期，轉基因植株胚根的根尖部位有顯示GUS活力的藍色出現(圖4-H、I)，且胚芽鞘及胚芽尖端也可見較明顯的藍色(圖4-H)，顯示該部位具有一定的GUS活性；隨幼苗進入營養生長后，成熟植株葉片也可見GUS染色呈陽性(圖4-G)。當水稻由營養生長轉入生殖生長后，取揚花期的小穗進行GUS染色，結果顯示，小穗的稃片(圖4-K)、穎花(圖4-L)及雄蕊的花藥(圖4-L)、雌蕊的柱頭及子房基部(圖4-M)等，均有顯示GUS活力的藍色出現，顯示這些組織中均具有較高的GUS活力水平。而在對照材料中，相應組織均未檢測到顯示GUS活力的藍色(圖4-A~F)。灌漿成熟期的種子經取材后縱切置于GUS液中染色，結果顯示種子的胚及胚乳中均有顯示GUS酶活性的藍色出現，但在種胚中能染出較強的藍色，表明灌漿后初步成熟的種子其胚中具有較強的GUS酶活性；胚乳中也可檢測到藍色出現，表明該部位也具備一定的GUS酶活(圖4-N)，而對照種子，其縱切后經GUS染色，均未在種胚及胚乳中檢測到顯示GUS活性的藍色(圖4-G)。綜合以上結果，初步顯示啟動子OsSRLp在水稻各組織中具有組成型的表達模式，且結合GUS染色強弱的不同，說明啟動子在植物各組織中驅動下游基因表達的強度有所不同，在具有較活躍分生能力的組織中，如胚根、胚芽的尖端及種子的胚等部位，表達強度較高，顯示啟動子在調控下游基因參與水稻特定的營養及生殖生長過程中發揮作用。

圖4 水稻幼苗及各組織的GUS染色結果

Fig. 4. GUS staining of rice seedlings and tissues.

表1 啟動子OsSRLp中的部分順式作用元件

3 討論

基因正常而有規律的表達保證了真核生物生長發育的正常進行，其中轉錄水平的調控，是基因表達調控中最有效、最直接的調控方式[13,14]。鑒于功能基因與啟動子在結構及位置上的相關性，故在獲得基因序列信息及開展基因功能研究的同時，獲得基因上游啟動子區，并進一步分析該區段中所包含的關鍵調控元件，通過解析啟動子所驅動的報告基因的表達情況，從而解析其下游調控基因的表達模式及生物學功能，是近年來開展基因功能研究的有效途徑[13]。

以往研究顯示，I型酪蛋白激酶是一類具有獨特理化特性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可參與到包括基因表達、生長及形態建成、生物節律性的維持及細胞增殖等多種細胞調節過程中[1-4]。前期研究中，我們在水稻中獲得一根發育異常突變體，結合表型及分子標記，定位到該突變基因屬于Ⅰ型酪蛋白激酶家族，命名為，其堿基突變可導致水稻初生根長度短于對照，側根數目減少，植株矮化。為了進一步解析該基因的功能，本研究分離獲得了上游約1600 bp序列并命名為OsSRLp，以之作為基因的啟動子區開展研究。

本研究發現OsSRLp包含大量參與植物生殖發育及節律調控的特征元件。其中涉及到營養生長相關的DOFCOREZME元件、EBOXBNNAPA元件及CANBNNAPA元件10余個，其中，DOFCOREZME元件作為Dof蛋白的結合位點，可能在調控植物種子萌發及光應答等多種生命過程中起作用[15,16]。OsSRLp包含7類節律調節及環境及激素響應元件，其中GT1CONSENSUS盒9個，已知在響應光信號過程中發揮作用[17-19]。涉及到4類開花及花粉發育等生殖相關的元件，其中POLLEN1LELAT52元件在OsSRLp中出現6次，已知在調控、轉錄激活花粉發育過程中發揮作用[20]。以往研究也顯示，水稻中組成型表達的Ⅰ型酪蛋白激酶OSCKI1，可通過響應激素處理及外界信號，從而參與植物發育，影響水稻根系的生長[1-2]。基因則可通過對光照及激素信號產生響應，從而對開花時間及花的育性進行調控[5]。而本研究將為進一步從植物發育、生殖及對外界信號響應等方面解析基因功能提供理論依據及指導。

基因為組成型表達，除了在灌漿成熟期的小穗中表達強度較高，在其他組織中的表達相對較弱。該基因的啟動子OsSRLp所驅動的GUS報告基因的表達模式則顯示，在揚花期的小穗中，包括雌蕊、雄蕊、稃片等部位，均具有較強的GUS酶活性，顯示啟動子在以上部位均具有較強的驅動及調控能力。推測啟動子OsSRLp可通過對下游基因的表達進行調控，從而參與水稻的生殖調控過程。另外，在水稻萌發期的胚根及胚芽頂端及灌漿成熟期的種子的胚中均可檢測到較強的GUS活力水平，已知這些部位作為植物的頂端分生組織或分生能力很旺盛的部位，在植物的生長及發育過程中均具有重要作用，而啟動子在這些部位所具有的較強的驅動下游基因表達的能力，顯示啟動子及其下游基因均參與了植物的生長及發育的調控。同時，突變體對干旱及ABA等脅迫處理較對照敏感(未發表)，結合其根部發育遲緩等表型特征，推測基因在調控植株吸水及水分利用、葉片氣孔發育及導度、及植株蒸騰失水等方面可能具有一定的作用。下一步將結合啟動子中所包含的幾類特征元件，進一步分析OsSRLp在不同發育階段及外界處理下的表達特征及響應強度；同時構建基因的植物表達載體，在獲得轉基因株系的基礎上，結合突變株的表型分析，深入解析啟動子的表達調控特性及其下游基因的作用及功能，為揭示Ⅰ型酪蛋白激酶的生物學功能，開展水稻分子設計育種提供理論指導。

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Isolation and Characteristic Analysis of Protein Kinase Promoter OsSRLp from Rice

WANG Qingguo1, WANG Yingying1, LI Zhen1, PAN Jiaowen1, WANG Yifan1, LI Yingxiu1, 2, LIU Wei1, 2,*

(1Biotechnology Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences /Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Ecology and Physiology, Jinan 250100, China;2College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014, China;*Corresponding author, E-mail: wheiliu@163.com)

【Objective】To study the construction and function ofa typeⅠcasein kinase, 【Method】and about 1600bp up-stream of the gene named as OsSRLp were isolated using genomic DNA of riceZhonghua 11. The regulatory elements of OsSRLp were analyzed using online software of PLACE, and the results showed that several key cis-elements which associated with reproductive process, signal and stress response were included. 【Results】The expression pattern analysis showed thatwas constitutively expressed in different tissues of rice. The fusion expression vector of OsSRLp and GUS was constructed, and the vector was transformed into rice callus. Afterpositive transgenic lines were obtained, the GUS activities were further detected, and the results showed thatrelative higher level expression was detected in spikelet, root and stem, as well as low expression levels in other rice tissues. The results indicated that OsSRLp possess constitutive activities with slightly variations in different rice tissues. 【Conclusion】 Combined with the characteristic elements and their potential functions of OsSRLp, the results implied thatand its promoter OsSRLp could participate in and regulate the development and reproduction progresses of plants.

rice; promoter OsSRLp; expression pattern; GUS activity; development and reproduction

Q755; S511.01

A

1001-7216(2018)04-0335-07

2017-10-26；

2017-12-28。

山東省自然科學基金面上項目(2016ZRC02178)；山東省自然科學基金資助項目(ZR2014CQ024)；山東省農業科學院青年英才計劃資助項目(2016-2018)；山東省農業科學院重大科技成果培育計劃資助項目(2015CGPY10)；國家重點研發計劃資助項目(2016YFD0100903)。

10.16819/j.1001-7216.2018.7127