荷多糖的提取工藝及其體外抑菌活性研究

黃仁術，汪瑩，陳坤，項學偉，徐興苗

摘要：在單因素實驗的基礎上，進行3因素3水平的Box-Behnken中心組合實驗設計，利用響應面分析優化■荷多糖的最佳提取工藝；對此工藝下的提取液進行濃縮，通過牛津杯法和二倍稀釋法探討其抑菌活性。結果表明：在優化工藝條件處理溫度91.67℃、液料比25.0mL/g、處理時間1.5h時，■荷多糖得率為10.15%，與預測值9.94%的相對誤差僅2.07%；■荷多糖對大腸桿菌、黑曲霉和釀酒酵母沒有體外抑制作用，但對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有體外抑制作用，其MIC分別為0.4930mg/mL、1.9722mg/mL，MBC分別為1.9722mg/mL、7.8886mg/mL。■荷多糖可作為一種新型抗菌藥物開發，其提取工藝可用響應面法進行回歸分析和參數優化。

關鍵詞：多糖；■荷；響應面；提取工藝；體外抑菌

項目基金：安徽省高校自然科學研究重點項目（KJ2018A0413）；安徽省林業科技攻關團隊（2017062）；安徽省林業科技攻關計劃項目（2018061）；安徽省2018年度重點研究與開發計劃項目（編號：1804g07020182）

中圖分類號： R931.71 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.14.029

■荷（Zingiber mioga （Thunb.） Rosc. ），又名陽荷、茗荷、觀音花、蓮花姜、野姜等，屬藥食兩用的姜科多年生草本植物，廣泛分布我國南方地區。而植物多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、增強免疫、調節造血功能等多種功效。但目前有關■荷多糖的研究仍比較少見，僅譚志偉等研究了傳統的熱浸提工藝和提取物的抗氧化性[1，2]，陳仕學等研究了微波輔助提取工藝[3]，邱嵐等研究了超聲輔助提取工藝[4]，朱培蕾等研究了■荷水溶性多糖的理化性質及其體外抗氧化活性[5]。本文在響應面法優化■荷多糖提取工藝的基礎上，對其抗菌活性進行研究，以期為■荷資源的有效開發和新型抗菌藥物的獲得提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

HH恒溫水浴鍋（金壇市金城國勝實驗儀器廠），SHZ-D循環水真空泵（鄭州予華儀器有限公司），H2050R臺式高速大容量冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），ZD-85氣浴恒溫振蕩器（金壇市杰瑞爾有限公司），DHP-9272數顯電熱培養箱（上海浦東榮豐科學儀器有限公司），YX-450電熱蒸汽壓力消毒器（上海三申醫療器械有限公司），SW-CJ-1C潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）等。硫酸、苯酚等均為分析純（西隴化工股份有限公司）。■荷從大別山區采集。實驗菌株包括以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）為代表的革蘭陽性細菌，以大腸桿菌（Escherichia coli）為代表的革蘭陰性細菌，以黑曲霉（Aspergillus niger）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為代表的真菌。

1.2 實驗方法

1.2.1 ■荷多糖的測定 根據苯酚-硫酸法，設置葡萄糖標準液的濃度梯度，建立其吸光度與葡萄糖質量M（μg）的線性關系，從而計算■荷多糖質量[6]。

1.2.2 確定單因素范圍

（1） 處理溫度（X1）：分別稱取3.0g過80目篩的■荷粉末，計5組3個重復共15份；每份用45mL蒸餾水溶于三角瓶后，各組分別置于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃的水浴中浸提2h；提取液4000轉速離心10min，Sevag法脫蛋白后濾液50mL容量瓶定容；取100uL提取液稀釋100倍，稀釋提取液，取其1mL按苯酚-硫酸法測定多糖濃度，以確定處理溫度。

（2）液料比（X2）：同上，按10mL/g的液料比梯度，確定15～45mL/g范圍內的液料比。

（3）處理時間（X3）：同上，按0.5h的時間梯度，確定1～3h范圍內的處理時間。

1.2.3 響應面優化 響應面采用Design-Expert.8.0.6軟件設計，處理溫度（X1）、液料比（X2）和處理時間（X3）為自變量，■荷多糖提取得率（Y）為響應值。

1.2.4 體外抑菌 純化供試菌種制成菌懸液備用。■荷多糖濃縮物體外抑菌效果以牛津杯法測定；■荷多糖最低抑菌濃度（MIC）以二倍稀釋法測定，對有抑菌效果的二倍稀釋液移種到培養基上，根據培養皿中菌落生長情況測定■荷多糖最小殺菌濃度（MBC）[7]。

2 結果與分析

2.1 ■荷多糖的測定

經測定，吸光度A與多糖質量M的線性關系為A=0.007M+0.0038，R=0.9998，相關系數符合國家標準高于0.99的要求，可作為測定依據[8]。

2.2 確定單因素范圍

表1 不同處理溫度對提取效果的影響

注：dfA=4，dfe=10；SSA=10.5976，SSe=0.9003；Sx=0.1732；**表示組間差異極顯著。

2.2.1 處理溫度 由表1的SSR法檢驗可見，在80℃～100℃時，■荷多糖的得率最高，與其他各組差異極顯著（P<0.01）；但在80℃～100℃之間差異不顯著（P>0.01），響應面法可進一步優化篩選此溫度范圍。考慮能源消耗，確定其他單因素范圍時可暫定80℃。

2.2.2 液料比 由表2的SSR法檢驗可見，隨著液料比的進一步提高，■荷多糖的得率極顯著降低（P<0.01）；但在15～25mL/g時差異不顯著（P>0.01），響應面法可進一步于5～25mL/g區間篩選液料比范圍，確定其他單因素范圍時可暫定液料比為15mL/g。

表2 不同液料比對提取效果的影響

注：dfA=3，dfe=8；SSA=2.2840，SSe=0.8691；Sx=0.1903；**表示組間差異極顯著。

2.2.3 處理時間篩選試驗 由表3的SSR法檢驗可見，隨著處理時間的增加或減少，■荷多糖得率都會極顯著性降低（P<0.01），■荷多糖得率最高時的處理時間為2h，響應面法篩選范圍可選擇1.5～2.5h區間。

表3 不同處理時間對提取效果的影響

注：dfA=4，dfe=10；SSA=16.2721，SSe=0.6024；Sx=0.1417；**表示組間差異極顯著，*表示顯著。

2.3 響應面優化

2.3.1 回歸方程與統計檢驗

響應面試驗結果見表4，經二次回歸分析得模型方程：Y=-44.16144+1.41778X1-0.050725X2-13.3595X3+0.00115X1X2

-0.0485X1X3-0.011X2X3-0.0074925X12+0.0046325X22+4.423X32。

表4 ■荷多糖提取響應面設計試驗方案及結果

根據數字模型方差分析結果看（表5）：模型的F=33.28、（Prob>F）<0.0001，表明該模型顯著而具有統計學意義；模型失擬項（Prob>F）=0.0564>0.05，表明失擬項不顯著，實驗和模型擬合程度好；模型的相關系數R2=0.9772>0.95，說明模型擬合度好而具有高可信度；變異系數（CV）=4.73%，信噪比22.552>4，表明模型方程能客觀反映實驗值。可見■荷多糖提取工藝可以憑該模型來預測。在模型方程中，X2偏回歸系數顯著（P<0.05），說明液料比對■荷多糖提取的效應影響顯著。

表5 ■荷多糖提取工藝優化數學模型方差分析

2.3.2 ■荷多糖提取的響應面分析

綜合圖1、圖2、圖3可見：隨著料液比的增加■荷多糖提取得率提高；隨著處理溫度的上升■荷多糖提取得率先提高后降低；隨著處理時間的延長■荷多糖提取得率先降低后提高。三者之間未見交互效應。

2.3.3 試驗驗證

經軟件優化計算，在處理溫度91.67℃、液料比25.0mL/g、處理時間1.5h時，■荷多糖的提取得率最大，達到9.94%。此工藝條件下驗證結果證實，■荷多糖實際提取得率10.15%，與預測值相對誤差僅2.07%。

2.4 體外抑菌試驗

2.4.1 牛津杯法測定■荷多糖抑菌效果

由圖4、圖5可知，■荷多糖濃縮液（7.8886mg/mL）對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有明顯的體外抑制作用；但對大腸桿菌、黑曲霉和釀酒酵母未見體外抑制作用。其中，■荷多糖對金黃色葡萄球菌的平均抑菌圈直徑為15.5mm；對枯草芽孢桿菌的平均抑菌圈直徑為9.6mm。

2.4.2 ■荷多糖的MIC、MBC測定（圖6，圖7）

由圖6可見，■荷多糖的濃縮液在第4支試管，即1/16倍稀釋前，試管中的金黃色葡萄球菌生長受抑制、培養液清亮，之后金黃色葡萄球菌生長、培養液混濁。各試管稀釋液轉種于培養皿后，至第2支試管，即1/4倍稀釋液在培養皿上的菌落數小于5個，而第3支試管開始，即1/8倍稀釋液轉種于培養皿后，菌落數多于5個。說明■荷多糖對金黃色葡萄球菌的MIC為其濃縮液的1/16倍稀釋液，即0.4930mg/mL；MBC為其濃縮液的1/4倍稀釋液，即1.9722mg/mL。

由圖7可見，■荷多糖的濃縮液在第2支試管，即1/4倍稀釋前，試管中的枯草芽孢桿菌生長受抑制、培養液清亮，之后金黃色葡萄球菌生長、培養液混濁。各試管稀釋液轉種于培養皿后，第1支試管，即1/2倍稀釋液在培養皿上的菌落數就多于5個，僅濃縮液原液的培養液在培養皿上未見菌落生長。說明■荷多糖對枯草芽孢桿菌的MIC為其濃縮液的1/4倍稀釋液，即1.9722mg/mL；MBC為其濃縮液原液，即7.8886mg/mL。

3 結論

本研究以■荷為原料，運用響應面法建立■荷多糖提取工藝的數學回歸模型為：Y=-44.16144+1.41778X1-0.050725X2-

13.3595X3+0.00115X1X2-0.0485X1X3-0.011X2X3-0.0074925X12+

0.0046325X22+4.423X32。通過模型得知■荷多糖的最佳工藝為處理溫度91.67℃、液料比25.0mL/g、處理時間1.5h，此工藝時■荷多糖實際提取得率達到10.15%，與預測值9.94%的相對誤差僅2.07%，表明響應面法適用于對■荷多糖提取得率進行參數優化與回歸分析。此工藝條件下提取的■荷多糖進行體外抑菌試驗，結果牛津杯法表明■荷多糖濃縮液在7.8886mg/mL時，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有體外抑制作用，對大腸桿菌、黑曲霉和釀酒酵母沒有體外抑制作用；■荷多糖對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC分別為0.4930mg/mL、1.9722mg/mL，MBC分別為1.9722mg/mL、7.8886mg/mL。

參考文獻

[1]譚志偉，余愛農.茗荷水溶性多糖提取及抗氧化性能測定[J].湖北農業科學，2008，47（02）：211-213.

[2]譚志偉.茗荷水溶性多糖體外抗氧化性能的研究[J].安徽農業科學，2008，36（02）：433-434，628.

[3]陳仕學，沈家國，陳波，等. 微波輔助提取梵凈山陽荷多糖的工藝優化[J].食品與發酵工業，2013，39（05）：234-237.

[4]邱嵐，陳仕學，王紅梅.超聲波輔助提取陽荷多糖的工藝研究[J].食品工業，2013，34（08）：21-24.

[5]朱培蕾，汪名春，趙士偉，等. ■荷水溶性多糖的理化性質及其體外抗氧化活性[J].食品工業科技，2017，38（02）：136-140.

[6]張惟杰.糖復合物生化研究技術[M].杭州：浙江大學出版社，1999：132-136.

[7]黃仁術，易凡.金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質體外抑菌試驗[J].江蘇農業科學，2015，43（01）：3087-310.

[8]GB/T 27404-2008，實驗室質量控制規范-食品理化檢測[S].2008.

作者簡介：黃仁術，碩士，副教授，研究方向：天然活性物質研究。