藍(lán)靛果花色苷對(duì)高脂血癥大鼠肝臟LDLR、ABCG1及ABCA1基因表達(dá)的影響

于 偉，張桂芳，宋雪建，甄井龍，遲曉星，王振宇

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；4.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程系，黑龍江 哈爾濱 150001）

藍(lán)靛果花色苷是一種來(lái)源極為廣泛的功能性天然食用色素，20世紀(jì)80年代后，基于生物類黃酮化學(xué)結(jié)構(gòu)的明確，人們從分子水平上對(duì)花色苷類化合物的性質(zhì)有了深刻的理解[1]。Tsuda等[2]用亞油酸自動(dòng)氧化系統(tǒng)、脂質(zhì)體系統(tǒng)、兔血紅細(xì)胞膜系統(tǒng)和鼠肝粗粒體系統(tǒng)對(duì)矢車菊色素葡萄糖苷和矢車菊色素的抗氧化活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的抗氧化活性，從而認(rèn)識(shí)到花色苷類化合物的性質(zhì)和應(yīng)用都根源于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)。花色苷的酚羥基結(jié)構(gòu)對(duì)活性氧等自由基有很強(qiáng)的捕捉能力[2-8]。花色苷類化合物通過(guò)清除自由基能對(duì)自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起到保護(hù)作用，維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性和蛋白質(zhì)的構(gòu)型構(gòu)象，具有明顯的抑制高血脂、預(yù)防心血管病效果[9-11]。從葡萄中提取的花色苷可以有效地降低膽固醇和低密脂蛋白的水平，預(yù)防血栓形成，有助于預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生[12]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)花色苷還可降低人體總膽固醇（total cholesterol，TC）含量（13%～26%），降低低密度脂蛋白膽固醇含量（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）（21%～33%）[13]，降低肝臟中甘油三酯（triglyceride，TG）含量[14]。

本課題組在前期的研究中通過(guò)液相色譜-二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)方法對(duì)藍(lán)靛果花色苷具體組成成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)藍(lán)靛果花色苷發(fā)揮降脂作用的有效成分可能為矢車菊-3-葡萄糖苷，并進(jìn)行了體內(nèi)降脂實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其能有效降低高脂血癥大鼠體內(nèi)LDL水平。目前對(duì)于藍(lán)靛果花色苷抗氧化及降血脂的分子機(jī)制尚不明確，以往對(duì)天然產(chǎn)物抑制膽固醇合成機(jī)制的研究，只考慮是否對(duì)合成的第一步或者限速酶（如HMGCoA還原酶）有抑制作用，很少考慮對(duì)膽固醇逆轉(zhuǎn)錄作用過(guò)程中相關(guān)因子的作用。那么，藍(lán)靛果花色苷降低血脂水平的主要途徑到底是什么？其作用機(jī)理又是如何呢？基于以上問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，利用Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）研究藍(lán)靛果花色苷對(duì)高脂血癥大鼠肝臟組織中低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）及膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（ATP-binding cassette transporter，ABCG）基因表達(dá)的影響。從基因表達(dá)水平上探索藍(lán)靛果花色苷對(duì)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中一些重要因子（LDLR、ABCG1及ABCA1）的調(diào)控作用，從而闡明藍(lán)靛果花色苷降血脂的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

Wistar大鼠由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，許可證編號(hào)：SYXK（黑）2011-007。高脂飼料：78.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）普通飼料、10.0%豬油、10.0%蛋黃粉、0.2%膽酸鈉、1.0%膽固醇。

藍(lán)靛果花色苷為本實(shí)驗(yàn)室提取。

EZNA FFPE RNA Kit 美國(guó)Bio-Tek公司；DEPC處理水 上海信帆生物有限公司；SYBR Green PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、培養(yǎng)基、血清、雙抗、胰酶 美國(guó)Thermo公司；異丙醇、無(wú)水乙醇、氯仿 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7300 Real-time PCR儀 美國(guó)ABI公司；TG-16M低溫冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；移液槍 法國(guó)吉爾森公司；K30旋渦振蕩器 上海青浦滬西儀器廠；PRO200電動(dòng)勻漿機(jī) 德國(guó)FLUKO公司；Q-TOF 6530質(zhì)譜儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型及分組

參考李迪[15]和熊霜[16]等的實(shí)驗(yàn)方法，選擇2 月齡雄性Wistar大鼠60 只，按體質(zhì)量隨機(jī)分成6 組，每組10 只。其中基礎(chǔ)飼料對(duì)照組，給予普通飼料；其余50 只SD大鼠給予高脂飼料，同時(shí)每天添加輔食油渣50 g，自由飲食飲水，每10 d稱一次體質(zhì)量。30 d后，斷尾取血，測(cè)血清TC、TG濃度。30 d造模后，實(shí)驗(yàn)性高脂血癥組大鼠TG濃度（（3.476±1.37）mmol/L）顯著高于正常組TG濃度（（1.936±0.532）mmol/L）（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)性高脂血癥組大鼠TC濃度（（2.415±0.278） mmol/L）顯著高于正常組（（1.703±0.477）mmol/L）（P＜0.05），說(shuō)明高脂飼料喂養(yǎng)的50 只SD大鼠均造模成功。

根據(jù)TC水平將高脂血癥大鼠隨機(jī)分為5 組：高脂血癥模型對(duì)照組（HFD，1.2 g/（kg·d mb）生理鹽水灌胃）、陽(yáng)性對(duì)照組（10 mg/（kg·d mb）辛伐他汀片灌胃）和藍(lán)靛果花色苷低、中、高劑量組（HFD＋L、HFD＋M、HFD＋H，分別給予4.0、40.0、120.0 mg/（kg·d mb）的花色苷灌胃[17]）。基礎(chǔ)飼料對(duì)照組（ND，1.2 g/（kg·d mb）生理鹽水灌胃）。

1.3.2 血脂指標(biāo)測(cè)定

每7 d測(cè)定大鼠體質(zhì)量1 次，35 d后，禁食不禁水24 h后斷尾采血、分離血清，分別測(cè)定大鼠血清中TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、LDL-C、載脂蛋白A（apolipoprotein A，Apo-A）和載脂蛋白B（Apo-B）的水平。HDL-C測(cè)定：清除法[18]；LDL-C測(cè)定：清除法[19]；TG測(cè)定：甘油磷酸氧化酶（glycerol phosphate oxidase，GPO）-過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶（peroxidaseanti-peroxidase，PAP）法[20]；膽固醇測(cè)定：膽固醇氧化酶（cholesterol oxidase，CHOD）-PAP法[21]；Apo-A：免疫比濁法[22]；Apo-B測(cè)定：免疫比濁法[22]。

1.3.3 RT-PCR檢測(cè)LDLR、ABCG1、ABCA1基因表達(dá)水平

稱取30 mg肝臟組織，常規(guī)Trizol提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃，60 min；85 ℃，5 min；4 ℃，5 min；置于－20 ℃保存。然后將制備好的cDNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s。數(shù)據(jù)采用儀器自帶ABI Prism 7300 SDS軟件分析；數(shù)據(jù)處理采用GraphPad Prism 5.0軟件。

NCBI primer designing tool設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，具體見表1。

表1 RT-PCR引物Table1 Primers used for RT-PCR

1.3.4 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LDLR蛋白表達(dá)水平

稱取30 mg大鼠肝臟組織，進(jìn)行總蛋白抽提。蛋白用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。利用垂直電泳儀進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白處于濃縮膠時(shí)電壓設(shè)置為80 V，蛋白進(jìn)入分離膠之后電壓調(diào)至120 V，電泳1 h。然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，即在電轉(zhuǎn)完畢后，將PVDF膜置于5%的脫脂奶粉（TBST配制）37 ℃中封閉2 h。分別進(jìn)行一抗和二抗孵育，一抗孵育：封閉結(jié)束之后，TBST清洗PVDF膜3 遍，分別加入以下一抗：兔LDLR（1∶200，V/V）、鼠β-actin（1∶5 000，V/V），4 ℃孵育過(guò)夜。二抗孵育：一抗孵育結(jié)束后，用TBST洗3 遍，鼠抗/兔抗（1∶2 000，V/V）二抗室溫孵育2 h，TBST脫色搖床清洗3 遍。最后 進(jìn)行免疫檢測(cè)：PVDF膜上均勻滴加ECL化學(xué)顯色液，發(fā)光強(qiáng)度用ImageQuant LAS 4000mini化學(xué)發(fā)光成像檢測(cè)儀檢測(cè)拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示，采用單因素方差Duncan分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)靛果花色苷對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

表2 藍(lán)靛果花色苷對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響（n＝ 10）Table2 Effect of LCA on rat body weight (n= 10)g

由表2可知，ND組大鼠體質(zhì)量在5 周內(nèi)處于平穩(wěn)狀態(tài)；HFD組大鼠體質(zhì)量呈上升趨勢(shì)，與ND組有顯著性差異（P＜0.01）。灌胃3 周后，HFD＋M組大鼠的體質(zhì)量下降，與ND組體質(zhì)量沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），與HFD組體質(zhì)量有極顯著性差異（P＜0.01）。灌胃4 周后，與HFD組比較HFD＋M組差異顯著（P＜0.01）；與ND組比較，HFD＋M組體質(zhì)量降低，差異顯著（P＜0.05）；與HFD組比較，HFD＋L、HFD＋H組差異顯著（P＜0.05）。灌胃5 周后，與HFD組比較，HFD＋M組差異極顯著（P＜0.01）；與ND組比較HFD＋M組體質(zhì)量降低，差異顯著（P＜0.05）；與HFD組比較HFD＋L、HFD＋H組差異顯著（P＜0.05）。綜上可知，不同劑量藍(lán)靛果花色苷對(duì)于大鼠體質(zhì)量都有一定的作用效果，但最適宜的條件為HFD＋M。

2.2 藍(lán)靛果花色苷對(duì)大鼠血脂指標(biāo)的影響

表3 藍(lán)靛果花色苷對(duì)大鼠血脂水平的影響（n＝10）Table3 Effect of LCA on blood lipid levels in rats (n= 10)

從表3可以看出，灌胃5 周后，TC和TG水平下降，與HFD組相比各劑量組均具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），其中HFD＋M組最為明顯（P＜0.01）。與HFD組相比，各劑量組HDL-C水平均升高，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。與HFD組相比，各劑量組LDL-C水平均降低，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），其中HFD＋M組最為明顯（P＜0.01）。與HFD組相比，各劑量組LDL-C/HDL-C均降低，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），其中HFD＋M、H組更為顯著（P＜0.01）。與HFD組相比，各劑量組Apo-A水平極顯著提高（P＜0.01）。與HFD組相比，各劑量組Apo-B水平也呈降低趨勢(shì)（P＜0.05）。綜上可知，花色苷處理后的大鼠各項(xiàng)指標(biāo)均得到相應(yīng)的改善，在HFD+M條件下，作用最為明顯。

2.3 藍(lán)靛果花色苷對(duì)大鼠肝臟組織中LDLR、ABCG1、ABCA1基因表達(dá)水平的影響

RT-PCR對(duì)各指標(biāo)mRNA檢測(cè)結(jié)果顯示（表4），經(jīng)藍(lán)靛果花色苷干預(yù)后，與HFD組比較，HFD＋L（1.69±0.84）、HFD＋M（3.06±1.23）、HFD＋H（3.41±1.18）組LDLR mRNA表達(dá)量均顯著性提高（P＜0.05）。與HFD組比較，HFD＋M（3.49±1.35）、HFD＋H（3.32±1.19）組ABCA1 mRNA表達(dá)量均提高，具有顯著性差異（P＜0.05）。與HFD組比較，HFD＋L（1.68±0.75）、HFD＋M（3.46±1.76）、HFD＋H（3.51±1.19）組ABCG1 mRNA表達(dá)量均提高，具有顯著性差異（P＜0.05）。與ND組比較，各指標(biāo)在HFD＋M、H均具有極顯著性差異（P＜0.01），而ABCA1在HFD＋L也具有顯著性差異（P＜0.05）。綜上可知，藍(lán)靛果花色苷在HFD＋M、H時(shí)對(duì)LDLR、ABCA1、ABCG1 mRNA有較好的促進(jìn)效果。

表4 藍(lán)靛果花色苷對(duì)大鼠肝臟組織中LDLR、ABCA1 and ABCG1 mRNA表達(dá)水平的影響（n＝10）Table4 Effect of LCA on the gene expression of LDLR, ABCA1 and ABCG1 in livers of rats (n= 10)

2.4 藍(lán)靛果花色苷對(duì)大鼠肝臟組織中LDLR蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)大鼠肝臟組織中LDLR蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)藍(lán)靛果花色苷干預(yù)后，與HFD組比較，HFD＋L（0.930±0.082）、HFD＋M（1.280±0.087）、HFD＋H（1.450±0.080）組LDLR蛋白水平均提高，且差異顯著（P＜0.05）（圖1），LDLR蛋白表達(dá)結(jié)果與mRNA一致。

圖1 藍(lán)靛果花色苷對(duì)大鼠肝臟組織中LDLR蛋白表達(dá)水平的影響Fig. 1 Effect of LCA on the protein expression of LDLR in livers of rats

3 討 論

LDLR的表達(dá)水平與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，人血液中70%的膽固醇由LDL和極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）攜帶，但絕大部分膽固醇結(jié)合于LDL中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。LDLR對(duì)LDL的吞噬和清除是LDL代謝過(guò)程中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，同時(shí)血液中約75%的LDL通過(guò)肝臟被清除，其中90%是通過(guò)LDLR途徑清除的[23]。LDLR是位于細(xì)胞表面的跨膜受體，是分子質(zhì)量約160 kD的糖蛋白，含839個(gè)氨基酸殘基。主要功能是參與LDL的代謝過(guò)程，血漿中LDL攜帶的膽固醇主要是通過(guò)肝細(xì)胞LDLR清除，LDLR對(duì)LDL的吞噬與清除是LDL代謝過(guò)程中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。許多物質(zhì)在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平均可調(diào)控LDLR基因的表達(dá)。本課題組前期的研究證實(shí)了藍(lán)靛果花色苷可降低大鼠血清中LDL-C的水平[17,24]。高脂血癥是引發(fā)冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等的首要危險(xiǎn)因素，有研究表明花色苷具有明顯的降低大鼠血漿TC、TG、LDL-C含量，增加HDL-C含量的功能[25-26]，本研究采用藍(lán)靛果花色苷進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從大鼠灌胃后的體質(zhì)量變化及血脂6 項(xiàng)的變化可以看出，辛伐他汀和花色苷對(duì)大鼠的體質(zhì)量和血脂都有不同程度的影響，均能減輕大鼠體質(zhì)量，降低大鼠血漿TC、TG、LDL-C含量，增加HDL-C含量；說(shuō)明花色苷降血脂效果明顯。另外，研究結(jié)果進(jìn)一步顯示在實(shí)驗(yàn)劑量下藍(lán)靛果花色苷可明顯增加高脂大鼠肝臟組織中LDLR蛋白和mRNA的表達(dá)量，從而降低LDL-C水平，調(diào)節(jié)體內(nèi)血脂含量。

Apo-A大部分分布在HDL中，是HDL的最主要載脂蛋白，與血漿HDL水平呈正相關(guān)[27-29]。動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、高脂蛋白血癥、肝功不足均可導(dǎo)致Apo-A水平的降低[30-32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藍(lán)靛果花色苷能有效升高高脂血癥大鼠血清中Apo-A和HDL的水平，花色苷中、高劑量組效果明顯。Apo-B存在于LDL的表面，與血漿Apo-B、LDL的水平也呈正相關(guān)，本研究結(jié)果顯示不同劑量的藍(lán)靛果花色苷可有效降低大鼠血清LDL-C水平，中劑量組Apo-B水平下降最明顯；提示藍(lán)靛果花色苷能對(duì)高脂模型大鼠的肝臟功能有很好的保護(hù)作用。

ABCG1和ABCA1是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞及各器官的吞噬細(xì)胞系統(tǒng)。ABCG1又可以作為轉(zhuǎn)運(yùn)體，將巨噬細(xì)胞中的膽固醇轉(zhuǎn)移至成熟型HDL，ABCG1途徑在巨噬細(xì)胞膽固醇流出中有重要的地位[33]。ABCG1能增加膽固醇外流，有利于細(xì)胞清除多余膽固醇并避免膽固醇在細(xì)胞內(nèi)堆積，但其具體機(jī)制至今仍不清楚。Freeman等[34]報(bào)道，ABCG1不僅在細(xì)胞表面調(diào)節(jié)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，還可調(diào)控細(xì)胞外膽固醇微結(jié)構(gòu)域的產(chǎn)生，在胞外區(qū)域發(fā)揮重要作用。對(duì)冠心病患者單核細(xì)胞ABCA1反應(yīng)性的影響已經(jīng)被證實(shí)[35-38]，同時(shí)有研究顯示膽固醇外流增加有助于減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變程度[39-41]。ABCA1和ABCG1的表達(dá)水平與膽固醇流出密切相關(guān)，二者分別負(fù)責(zé)把細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外的Apo A-I和HDL，在維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇的動(dòng)態(tài)平衡、阻止脂質(zhì)在巨噬細(xì)胞內(nèi)的聚集中發(fā)揮著重要作用[42-44]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示40.0、120 mg/（kg·d mb）劑量下的藍(lán)靛果花色苷可有效增加高脂大鼠肝臟組織中ABCA1和ABCG1基因表達(dá)水平，影響膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)。

綜上分析，通過(guò)對(duì)高脂血癥大鼠進(jìn)行藍(lán)靛果花色苷干預(yù)，測(cè)定血脂水平、肝臟LDLR及其相關(guān)基因ABCG1和ABCA1 mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)劑量下藍(lán)靛果花色苷可有效調(diào)節(jié)高脂大鼠體內(nèi)的血脂指標(biāo)，增加動(dòng)物體內(nèi)LDLR蛋白和基因的表達(dá)水平，降低膽固醇含量，其作用機(jī)制可能與其調(diào)控膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而增加膽固醇外流，調(diào)節(jié)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。