UNBS5162對腦膠質瘤細胞增殖和轉移的抑制作用及機制

劉 冰 霍會永 馮社軍 曹 凌 趙 現 曹 妍 薛 靖 王如科 李軍濤

目前，腦膠質瘤的治療仍是醫學上的一個難題，現階段主要以手術切除為主，術后輔以放療和化療，但總體治療效果不理想，主要是由于惡性膠質瘤的侵襲性行為導致腫瘤無法全切以及腦膠質瘤固有的對化療及放療的抗性造成[1]。萘酰亞胺類化合物是一種DNA嵌入劑，具有良好的抗腫瘤活性[2]。UNBS5162是一種特殊的萘二甲酰亞胺，能減少前列腺癌中趨化因子配體[chemokine (C-X-C motif) ligand，CXCL]表達[3]，對體內、外多種腫瘤細胞的增殖具有良好的抑制作用[4]。本研究通過體外實驗，觀察UNBS5162對腦膠質瘤細胞U251增殖、遷移和侵襲的抑制作用，通過檢測細胞凋亡相關蛋白[B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)]及磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號通路相關蛋白[AKT、哺乳動物雷帕霉素靶向基因(mammalian target of rapamycin，mTOR)、70S核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase beta-1，p70S6K)]的表達情況，探討UNBS5162對腦膠質瘤細胞的抗腫瘤作用及機制，為研究高效、低毒的抗腫瘤藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 腦膠質瘤細胞U251(上海中科院細胞庫)，HY-16509 UNBS5162 (美國MCE公司)，RPMI-1640培養液(美國HYCLONE公司)，血清(美國Gibco公司)，雙抗(美國SIGMA公司)，0.25%胰酶消化液[加乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)]購于北京索萊寶公司，RIPA(radio immunoprecipitation assay)蛋白裂解液、BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物(北京康為世紀生物科技有限公司)，Transwell小室(美國Millipore公司)，CCK8-kit(北京索萊寶公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(北京四正柏公司)，一抗(兔抗人)AKT、p-AKT、mTOR 、p-mTOR(美國CST)，p70S6K、Bcl-2、Bax、活化的Caspase-3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、辣根過氧化物酶(horseradish Peroxidase，HRP)標記的羊抗兔/羊抗鼠二抗(美國PTG)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 采用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養液培養腦膠質瘤細胞U251，置于37℃、5%CO2培養箱內常規培養。待細胞進入對數生長期，用PBS清洗3次，經胰酶消化，細胞變圓后，加入培養液終止消化，反復吹打為單細胞懸液，種植到6孔板中進行后續實驗。UNBS5162處理的細胞作為實驗組(UNBS5162)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)處理的細胞作為對照組。

1.2.2 CCK8增殖檢測 將對數生長期U251細胞消化計數，取懸液100 μL，以每孔1 000個細胞的標準種到96孔板中，每組設置5個復孔。對照組加1‰ DMSO，實驗組加入UNBS5162，于CO2培養箱中常規培養，每隔24 h檢測1次細胞活力，檢測前，每孔加10 μL CCK8試劑，37℃培養箱中孵育1.5 h，450 nm酶標儀檢測吸光度A值，以A450值間接反映細胞存活數量和增殖能力。

1.2.3 Transwell侵襲和遷移實驗 侵襲實驗：采用Transwell小室法構建侵襲模型，將提前過夜融化的Matrigel基質膠100 μL(無血清培養液按1∶6稀釋)加入到24孔板的Transwell上室中，于37℃、CO2培養箱中靜置4～6 h成膠，吸干培養液，下室中加500 μL無血清培養液，靜置30 min,水化基底膜。用無血清RPMI-1640制備細胞懸液，將100 μL細胞懸液(1×105個)加入上室中，下室中加入500 μL完全培養液。過夜，取出小室，棉簽擦掉上室中殘余的細胞，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min。0.1%結晶紫染色20 min，PBS清洗后，顯微鏡下隨機選取5個視野，拍照觀察計數。

遷移實驗：步驟類似侵襲實驗，Transwell小室無需 Matrigel基質膠處理，加入Transwell上室中的細胞數目調整為5 000個。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 采用10 μmol/L UNBS5162處理細胞24 h為實驗組，對照組細胞為DMSO處理，更換成無血清培養基，常規條件下，饑餓培養24 h。收集實驗組以及對照組細胞進行離心(1 000 r/min，5 min)，4℃預冷的PBS洗2次，加入緩沖液重懸細胞，調節細胞密度為(1～5)×106/mL。取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL 細胞凋亡檢測試劑Annexin V-FITC于室溫避光孵育5 min。加10 μL碘化丙啶(propidium Iodide，PI)染液與400 μL PBS，進行檢測。采用FlowJo軟件對流式結果進行分析處理。

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測(Western blot) U251細胞經10 μmol/L UNBS5162處理24 h后，RIPA裂解細胞提取細胞總蛋白，BCA法測定其濃度。每個樣本取20 μg蛋白通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)進行分離，轉膜后，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗人Bcl-2、Bax、活化的Caspase-3、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p70S6K(一抗濃度1∶1 000)4℃孵育過夜，采用TBST(tris buffered saline tween)緩沖液清洗3次，每次5 min，加入HRP標記的羊抗兔/羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，洗膜后，加增強化學發光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)顯影。QUANTITY ONE 軟件掃描灰度值，以GAPDH為內參，以目的蛋白灰度值/內參灰度值形式計算各蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 UNBS5162對U251細胞增殖的影響 10 μmol/L UNBS5162處理細胞24 h后，CCK8實驗結果表明，實驗組吸光度值低于對照組(P<0.05)；繼續培養48 h和72 h后，U251細胞增殖能力依然低于對照組(P<0.05)。詳見表1。

表1 UNBS5162對U251細胞增殖的影響(吸光度A值，

2.2 UNBS5162對U251細胞侵襲和遷移的影響 10 μmol/L UNBS5162處理細胞24 h后，Transwell實驗顯示，與對照組相比，實驗組細胞侵襲數減少[(18±5)個 比 (32±2)個，t=4.503，P=0.011]，實驗組細胞遷移數也同樣降低[(30±2)個 比 (78±4)個，t=18.590，P<0.001]。詳見圖1。

圖1 UNBS5162對 U251細胞遷移和侵襲的影響

注：A為對照組侵襲細胞；B為實驗組侵襲細胞；C 為對照組遷移細胞；D為實驗組遷移細胞

2.3 UNBS5162對U251細胞的凋亡的影響 與對照組相比，10 μmol/L UNBS5162處理細胞24 h后，實驗組U251細胞凋亡率增加[(24.46±2.03)% 比 (5.75±0.74)%，t=14.998，P<0.001)。Western blot實驗顯示，與對照組相比，UNBS5162處理后U251細胞中Bcl-2表達量下降[(0.36±0.032) 比 (1.00±0.043)，t=20.681，P<0.001]，而Bax和活化的Caspase-3表達量均上升[(1.69±0.141) 比 (1.00±0.067)，t=7.689，P=0.002；(1.35±0.066) 比 (1.00±0.055)，t=7.056，P=0.002]。詳見圖2。

圖2 UNBS5162對U251細胞凋亡的影響

注：A為流式細胞檢測細胞凋亡；B為Western blot檢測凋亡相關蛋白

2.4 UNBS5162對U251細胞中PI3K/AKT信號通路的影響 Western blot實驗顯示，與對照組相比，實驗組細胞中AKT和mTOR的磷酸化水平(p-AKT、p-mTOR)受到抑制[(0.654±0.097) 比 (1.000±0.084)，t=4.670，P=0.009；(0.599±0.070) 比 (1.000±0.098)，t=5.767，P=0.004]，其下游細胞增殖相關蛋白p70S6K表達水平也相應降低[(0.703±0.094) 比 (1.000±0.108)，t=3.593，P=0.023]。詳見圖3。

圖3 UNBS5162處理對PI3K/AKT 通路關鍵蛋白表達的影響

3 討論

作為抗腫瘤藥物，萘酰亞胺類化合物作用顯著，不僅能嵌入DNA，抑制DNA和RNA的合成，同時也能抑制拓撲異構酶，己成為近幾年研究的熱點之一[5-7]。UNBS5162是一種特殊的萘酰亞胺衍生物，目前研究多集中于其在腫瘤新血管生成和細胞自體吞噬中的作用[8-10]，而對于UNBS5162在腫瘤細胞抑制作用方面研究較少。本研究中，采用10 μmol/L UNBS5162處理膠質瘤細胞U251后，通過CCK8實驗檢測發現，UNBS5162能夠顯著降低U251細胞增殖能力，其表現的抑制腫瘤細胞增殖能力與前人在其他腫瘤中的實驗結果相似[11]。另外，本研究通過Transwell實驗檢測還發現，UNBS5162處理后U251細胞遷移和侵襲數顯著低于對照組，表明UNBS5162還能夠抑制U251細胞遷移和侵襲能力。以上結果提示UNBS5162對膠質瘤細胞生長和轉移具有一定的抑制作用。近些年，隨著分子生物學和細胞生物學的迅速發展，以及對細胞凋亡現象、細胞凋亡相關蛋白和細胞凋亡相關疾病的廣泛深入的研究，人們已經對細胞凋亡的信號傳導通路有了一定程度的了解。本研究發現，UNBS5162能促進U251細胞凋亡，導致U251細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達量下降，促凋亡蛋白Bax、活化的Caspase-3表達量上升，提示UNBS5162可通過誘導凋亡相關蛋白的變化促進膠質瘤細胞凋亡。結合前人研究[11]，本研究認為UNBS5162可作為一個潛在的抗腫瘤試劑用于抑制膠質瘤生長和轉移。

膠質瘤的發生涉及多種原癌基因和抑癌基因的結構與功能異常，是一種多基因異常疾病。PI3K/AKT信號轉導通路在膠質瘤的增殖、轉移、血管生成及對放化療藥物的耐藥等細胞活動中起重要作用[12-15]。AKT可調節眾多生物學事件，如生存和凋亡、轉錄、翻譯、侵襲和遷移、細胞周期調控、血管生成和端粒的維持。mTOR是一種不典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能磷酸化AKT的第473位絲氨酸并使之活化，進而激活AKT的活性。AKT也可通過磷酸化mTOR的Ser-448 位點而激活mTOR，mTOR可磷酸化下游分子核糖體蛋白p70S6K，進而激活其促進細胞增殖等相關功能，促進蛋白質的合成，與腫瘤發展進程密切相關[16-18]。本研究通過Western blot檢測發現，UNBS5162能抑制U251細胞中AKT和mTOR的磷酸化水平，且下游細胞增殖相關蛋白p70S6K表達水平也相應降低。以上結果有力地證明了UNBS5162對腦膠質瘤細胞的抑制作用與PI3K/AKT信號通路的激活有關。

綜上所述，UNBS5162對腦膠質瘤細胞U251的增殖、遷移和侵襲具有顯著抑制作用，能夠促進膠質瘤細胞U251凋亡，其分子機制可能與UNBS5162抑制PI3K信號通路的激活有關。