溴氰菊酯對中華絨螯蟹血細(xì)胞DNA的損傷

洪宇航，黃 毅

( 西昌學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，攀西動物疫病監(jiān)測與防控重點實驗室，四川 西昌 615000 )

作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中提升農(nóng)作物產(chǎn)量的有效手段，農(nóng)藥的使用至今已有上百年的歷史。傳統(tǒng)的有機(jī)磷類和有機(jī)氯類農(nóng)藥由于其較強(qiáng)的生態(tài)危害和對人畜的副作用而逐漸被減少使用[1]。相比之下，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥由于其高光穩(wěn)定性、高降解、低殘留以及對哺乳動物低毒等特點而在世界范圍內(nèi)被廣泛使用[2]。溴氰菊酯化學(xué)名稱為 (1R)-順式-2,2-二甲基-3-(2,2-二溴乙烯基)環(huán)丙烷羧酸-(S)-a-氰基-3-苯氧基芐酯，分子式:C22H19Br2NO3，分子量:505.21，純品為白色斜方形針狀晶體，常溫下幾乎不溶于水，溶于丙酮及二甲苯等大多數(shù)芳香族，是農(nóng)藥敵殺死的主要成分，為常用擬除蟲菊酯類農(nóng)藥之一[3]。其主要通過產(chǎn)生DNA雙鏈、單鏈斷裂以及姐妹染色單體交換等現(xiàn)象對各種動物血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、肝、腸等組織和細(xì)胞產(chǎn)生遺傳毒性[4-5]。由于它具有高效、廣譜、殘留少等特點，被廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)作物蟲害防治[6]。近年來，隨著工業(yè)發(fā)展及水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的擴(kuò)大，溴氰菊酯也被大量用于漁業(yè)生產(chǎn)活動，如蝦池、灘涂養(yǎng)殖池塘的清塘或毒殺敵害生物等[7]。因此，溴氰菊酯對水生動物的毒性作用成為水產(chǎn)養(yǎng)殖和環(huán)境生態(tài)領(lǐng)域的熱點之一。但是，關(guān)于溴氰菊酯對水生生物的毒性研究目前主要集中在魚類、貝類以及小型甲殼動物，而對于蝦蟹類則鮮有報道[8]。

中華絨螯蟹(Eriochiersinensis)是我國本土重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品種，年產(chǎn)量超過8×105t，產(chǎn)值超過300億元。其中，稻蟹混合養(yǎng)殖模式是河蟹養(yǎng)殖中重要的生產(chǎn)模式之一。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，其質(zhì)量安全問題越來越受到消費者的關(guān)注。而生產(chǎn)中溴氰菊酯的使用，特別是稻蟹養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)溴氰菊酯的直接或間接使用，會對中華絨螯蟹的健康養(yǎng)殖產(chǎn)生潛在威脅。目前關(guān)于溴氰菊酯對中華絨螯蟹毒性作用的研究已有一例報道，在質(zhì)量濃度為5.00 μg/L藥液中，約3 h中華絨螯蟹很快活力減弱，表現(xiàn)出四肢無力或顫抖的癥狀，個別個體附肢脫落，最后全部死亡。在較低含量如0.5 μg/L藥液中，中華絨螯蟹死亡時間明顯延長，部分中華絨螯蟹還能逐步恢復(fù)活力。但其結(jié)果僅探討了溴氰菊酯對不同生長階段中華絨螯蟹的急性毒性，并未進(jìn)一步研究對中華絨螯蟹的遺傳毒性作用[9]。

彗星檢測又稱單細(xì)胞凝膠電泳，通過電泳后DNA的拖尾長度定量檢測細(xì)胞中的DNA損傷程度，是評價外源因子對目標(biāo)生物基因毒性的重要指標(biāo)[10]。彗星檢測作為評價毒物遺傳毒性的重要工具，自1978年開發(fā)以來被廣泛使用于各領(lǐng)域，包括遺傳毒理、環(huán)境監(jiān)測等。其在個體暴露于空氣污染物、金屬、農(nóng)藥、輻射等有害異物的損傷評價中有良好的指示作用[11]。近年來，在水生環(huán)境監(jiān)測中有較多的應(yīng)用。有報道指出，彗星檢測較其他常用的遺傳生態(tài)毒理學(xué)生物指標(biāo)有更好的敏感性[12]。目前，彗星檢測在外源毒物對水生動物的基因毒性檢測中已有多例報道，但主要集中在海洋魚類、貝類及小型甲殼類，而針對淡水甲殼類的研究較少[13-15]，僅有小型甲殼類如大型溞(Daphniamagna)[16]和鉤蝦(Gammarusfossarum)[17]的報道。因此，本試驗參考溴氰菊酯對中華絨螯蟹的毒性結(jié)果及在生產(chǎn)中的水體殘留狀況，通過對中華絨螯蟹進(jìn)行不同劑量溴氰菊酯暴露，并利用彗星檢測技術(shù)探究其對免疫功能主要執(zhí)行者——血細(xì)胞的DNA損傷情況，為進(jìn)一步研究菊酯類農(nóng)藥對中華絨螯蟹的毒理機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為菊酯類農(nóng)藥在淡水經(jīng)濟(jì)甲殼類動物中的毒性評價體系的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及藥品

試驗用中華絨螯蟹采自江蘇省金壇市水產(chǎn)技術(shù)推廣站中華絨螯蟹標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖場，試驗前循環(huán)系統(tǒng)中暫養(yǎng)7 d以上。挑選健康無病、規(guī)格均等的中華絨螯蟹雌雄各半用于試驗，平均體質(zhì)量(14.5±3.2) g。溴氰菊酯乳劑購自德國拜耳作物科學(xué)有限公司，有效含量25 g/L。溶劑丙酮購自成都科龍化工試劑廠，分析純。

1.2 試驗設(shè)計

溴氰菊酯乳劑加入丙酮配制成25 μg/L儲備液待用。參考溴氰菊酯在中華絨螯蟹毒性試驗中的安全質(zhì)量濃度和96 h半致死質(zhì)量濃度[9]，以及生產(chǎn)中溴氰菊酯在養(yǎng)殖水體中的殘留量[18]，設(shè)置0.10、0.20、0.40 μg/L 3個質(zhì)量濃度組，0 g/L的空白對照組以及只添加丙酮的溶劑對照組。每組中華絨螯蟹30只，設(shè)置3個平行，每個125 cm×60 cm×60 cm水族箱中隨機(jī)放入10只中華絨螯蟹，加入經(jīng)充分曝氣的自來水50 L，并在箱底放置經(jīng)消毒處理的聚氯乙烯瓦片作為遮蔽物。試驗采用半靜水法，日換水一次，提前配置相同含量溴氰菊酯溶液以保證試驗含量不變。光暗周期12 h∶12 h，試驗期間每日8:00和19:00投喂人工配合飼料，并于投喂后3 h清除殘餌和排泄物。試驗期間每日測量水溫和水質(zhì)指標(biāo)，保證水溫(20±2) ℃，pH 7.2～7.8, 溶解氧>5 mg/L，氨氮<0.5 mg/L, 亞硝酸鹽<0.15 mg/L。分別于1、2、4、8、12 d觀察中華絨螯蟹存活情況，每組任意選取3只收集血細(xì)胞用于彗星檢測。

1.3 細(xì)胞懸液的制備

每個采樣時間點獲得中華絨螯蟹后立即進(jìn)行抗凝血采集。1 mL無菌注射器從第五步足基部基膜處采血，血淋巴與4 ℃預(yù)冷的抗凝劑(檸檬酸三鈉 4.41 g，NaCl 9.88 g，葡萄糖11.39 g，EDTA 1.46 g，蒸餾水 500 mL)1∶1混合均勻。采集的抗凝血立即于4 ℃、1000 r/min條件下離心5 min，去上清液得到血細(xì)胞沉淀。蟹生理鹽水(NaCl 14.5 g，KCl 0.355 g， CaCl20.899 g，MgSO4·7H2O 1.58 g，NaHCO30.25 g，MgCl2·6H2O 0.85 g，HEPES 2.38 g，蒸餾水500 mL)清洗一次，再加入1 mL蟹生理鹽水均勻吹打形成血細(xì)胞懸液。臺盼藍(lán)拒染法測定血細(xì)胞活性，確保血細(xì)胞存活率大于90%用于后續(xù)試驗。調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/mL 待用。

1.4 彗星試驗方法

彗星試驗方法根據(jù)文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行改良，分別配制0.8%正常熔點瓊脂糖及1%低熔點瓊脂糖放置于恒溫混勻器(Thermo，美國)中保溫待用。

1.4.1 制片

取100 μL 0.8%正常熔點瓊脂糖滴至單面磨砂載玻片磨砂面，蓋上蓋玻片并迅速放入4 ℃冰箱冷卻10 min。將鋪有第一層凝膠的載玻片取出后，移去蓋玻片，在第一層膠上平鋪混勻的含25 μL細(xì)胞懸液和50 μL 1%低熔點瓊脂糖的混合液，蓋上蓋玻片后立即4 ℃放置10 min進(jìn)行冷卻凝固。將載玻片取出后移去蓋玻片，在第二層凝膠上平鋪1%低熔點瓊脂糖100 μL，蓋上蓋玻片4 ℃放置30 min。

1.4.2 裂解

移去蓋玻片，將載玻片浸入新鮮配制的細(xì)胞裂解液(2.5 mol/L NaCl，0.1 mol/L Na2EDTA，10 mmol/L Tris-HCl， pH 10，用前加入10%Triton X-100，10%DMSO)中4 ℃裂解40 min。

1.4.3 電泳

將載玻片取出后用PBS漂洗2次，在電泳槽中倒入堿性電泳液(300 mmol/L NaOH, 1 mmol/L EDTA, pH 13)，約超過載玻片0.25 cm，25 V, 200 mA條件下電泳30 min。

1.4.4 中和及染色

電泳完畢后，PBS漂洗2次。用預(yù)冷的中和液(0.4 mol/L Tris-HCl, pH 7.5)中和3次，每次5 min。之后每張載玻片滴加20 μL碘化丙啶染液，避光染色10 min。

1.4.5 觀察并計數(shù)

染色結(jié)束后在倒置熒光顯微鏡(Leica DMi8，德國)下進(jìn)行觀察并拍照。每張載玻片隨機(jī)觀察10個視野，CASP 軟件對彗星圖像進(jìn)行分析。

拖尾率/%=拖尾細(xì)胞數(shù)/視野細(xì)胞總數(shù)

Olive尾矩=彗星細(xì)胞尾長×尾部DNA含量

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗，不滿足齊性方差時對數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦或者平方根處理，采用ANOVA對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，LSD和Duncan 法進(jìn)行多重比較，取P<0.05為差異顯著，P<0.01為極顯著，在GraphPad Prism 5軟件上繪制相關(guān)圖表。不同質(zhì)量濃度溴氰菊酯暴露下Olive尾距與暴露時間的回歸曲線通過Excel 軟件計算并繪制。

2 結(jié) 果

空白對照組和溶劑對照組血細(xì)胞染色后呈圓形熒光團(tuán)，DNA結(jié)構(gòu)較為緊密(圖1a,b)。而其余各組均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞拖尾現(xiàn)象，如形成較短彗尾的輕度拖尾，形成較長彗尾的中度拖尾以及形成掃帚狀，拖尾最長的重度拖尾。且隨著試驗質(zhì)量濃度增加，拖尾現(xiàn)象越加明顯，表明DNA受損程度越深(圖1c～e)。

圖1 不同含量溴氰菊酯暴露下中華絨螯蟹血細(xì)胞損傷的彗星圖像a：空白對照組；b：溶劑對照組；c：0.10 μg/L組；d：0.20 μg/L組；e：0.40 μg/L組.

試驗結(jié)果顯示，對照組各時間點拖尾率約為5%，受損細(xì)胞極少。溶劑組各時間點拖尾率及Olive尾距同對照組均差異不顯著(P>0.05)，表明溶劑丙酮并非導(dǎo)致中華絨螯蟹血細(xì)胞DNA損傷的原因。由圖2可知，在0.20 μg/L和0.40 μg/L質(zhì)量濃度下，早在1 d即出現(xiàn)一定程度的拖尾現(xiàn)象，其血細(xì)胞拖尾率顯著高于對照組(P<0.05)，其中0.20 μg/L組極顯著高于對照組(P<0.01)。隨著溴氰菊酯含量的增加，在此后各時間點各組拖尾率均呈逐漸增高的趨勢，表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)；此外，隨著暴露時間的增加，各試驗組血細(xì)胞拖尾率較先前也呈上升趨勢，均極顯著高于對照組(P<0.01)，具有明顯的時間效應(yīng)。至12 d時，0.10 μg/L組拖尾率已高達(dá)(61.68±6.21)%，多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象。

不同質(zhì)量濃度溴氰菊酯暴露下各時間點中華絨螯蟹血細(xì)胞彗星Olive尾距見圖3，其中對照組和溶劑組Olive 尾距極低，特別是對照組幾乎接近于0，表明對照組和溶劑組中血細(xì)胞DNA并未發(fā)生斷裂或斷裂極少，而其余各組均極顯著高于對照組，證明血細(xì)胞DNA有明顯斷裂。Olive尾距變化趨勢同拖尾率相同，也具有劑量—時間效應(yīng)。不同劑量溴氰菊酯下Olive 尾距與暴露時間的回歸分析表明，0.20 μg/L組Olive 尾距與暴露時間有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.8148；而0.10 μg/L組與0.40 μg/L組Olive尾距與暴露時間相關(guān)性較差，相關(guān)系數(shù)分別為0.6902和0.7029(圖4)。

圖2 不同含量溴氰菊酯暴露下彗星檢測拖尾率變化*為差異顯著(P<0.05)，**為差異極顯著(P<0.01),下同.

圖3 不同含量溴氰菊酯暴露下彗星檢測Olive尾距變化

圖4 不同含量溴氰菊酯暴露下Olive尾距與暴露時間的回歸曲線

3 討 論

關(guān)于溴氰菊酯對水生生物的研究，目前國內(nèi)外有很多報道，但主要集中在魚類，而鮮見關(guān)于甲殼動物的報道。姜輝等[19]總結(jié)菊酯類農(nóng)藥對水田生物的影響認(rèn)為，大多數(shù)菊酯類農(nóng)藥對魚類的96 h 半致死質(zhì)量濃度要比蝦類高1～2個數(shù)量級。因此，生產(chǎn)中存在利用低含量溴氰菊酯作為治療魚類寄生蟲病，并用于殺滅魚塘中甲殼類的情況[20]。大量使用的溴氰菊酯隨著農(nóng)田排水或雨水沖淋，對中華絨螯蟹以及其他經(jīng)濟(jì)甲殼類養(yǎng)殖水體產(chǎn)生較大安全影響。耿雪冰[9]通過對不同規(guī)格中華絨螯蟹進(jìn)行溴氰菊酯急性毒性試驗，得出溴氰菊酯對中華絨螯蟹成蟹和幼蟹的48 h 半致死質(zhì)量濃度分別為0.65、0.42 μg/L，安全質(zhì)量濃度分別為0.46、0.19 μg/L，屬于高毒農(nóng)藥。但其并未進(jìn)一步研究溴氰菊酯對于中華絨螯蟹生理及免疫，特別是遺傳毒理方面的影響。由于本試驗所用中華絨螯蟹規(guī)格為(14.5±3.2) g，與上述研究中所用中華絨螯蟹幼蟹規(guī)格(17.9±1.9) g相近，且在預(yù)試驗中0.65 μg/L溴氰菊酯質(zhì)量濃度下中華絨螯蟹96 h 死亡率超過80%，因此選取接近其96 h半致死質(zhì)量濃度的0.40 μg/L溴氰菊酯作為最高質(zhì)量濃度，低于其安全質(zhì)量濃度的0.10 μg/L作為最低質(zhì)量濃度，旨在探討亞致死質(zhì)量濃度條件及安全質(zhì)量濃度下溴氰菊酯對中華絨螯蟹的遺傳毒性作用。

彗星試驗分析指標(biāo)眾多，包括拖尾率、尾長、彗尾DNA含量、尾距及Olive尾距等。拖尾率作為最早使用的指標(biāo)，可以方便、直觀地體現(xiàn)毒物對標(biāo)靶生物的遺傳毒性大小。但由于其具有一定主觀性，因此在后來的研究中又加入了尾距及Olive尾距復(fù)合指標(biāo)，可以更加全面地對毒物的遺傳毒性進(jìn)行評價[10-11]。本試驗采用拖尾率和Olive尾距兩項指標(biāo)檢測溴氰菊酯對中華絨螯蟹血細(xì)胞的DNA損傷程度。結(jié)果表明，溴氰菊酯可以造成中華絨螯蟹血細(xì)胞明顯的DNA損傷，即使是0.10 μg/L最低質(zhì)量濃度組，在1 d后拖尾率和Olive尾距也顯著高于對照組，表明溴氰菊酯對中華絨螯蟹遺傳毒性較強(qiáng)，且產(chǎn)生毒害作用十分迅速，在1 d內(nèi)即可造成損傷。蔡道基等[18]通過稻田施用生產(chǎn)用量的溴氰菊酯，并模擬下雨將農(nóng)田水排入魚塘，測定了池塘水體及底泥中溴氰菊酯的殘留。結(jié)果顯示，溴氰菊酯排入池塘中其質(zhì)量濃度4 h后可達(dá)最高峰，平均為0.41 μg/L，隨后迅速降解，14 h后不再檢出。因此，雖然溴氰菊酯在養(yǎng)殖水體中降解較快，但仍可能在短時間內(nèi)造成中華絨螯蟹血細(xì)胞DNA損傷，從而引發(fā)其他的免疫功能缺陷，影響其生長存活。這一結(jié)果同多氯聯(lián)苯對櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[21]的毒性作用的研究結(jié)論相似。在0.5 μg/L多氯聯(lián)苯暴露下，櫛孔扇貝血細(xì)胞在1 d后即出現(xiàn)顯著的拖尾現(xiàn)象。房燕等[22]的研究也表明，在鎘和汞復(fù)合脅迫下，即使最低質(zhì)量濃度也可在1 d后引起四角蛤蜊(Mactraveneriformis)血細(xì)胞出現(xiàn)明顯DNA損傷，其Olive尾距顯著高于對照組。本研究還發(fā)現(xiàn)，血細(xì)胞拖尾率和Olive尾距在試驗過程中出現(xiàn)明顯的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)，至12 d達(dá)到峰值，表明溴氰菊酯引起的DNA損傷隨著暴露時間的增加而愈加嚴(yán)重，且在短時間內(nèi)難以恢復(fù)。良好的時間和劑量同DNA損傷的相關(guān)性也表明拖尾率和Olive尾距這兩個指標(biāo)可以作為敏感的生物標(biāo)志物在溴氰菊酯遺傳毒性檢測中應(yīng)用。這同Nwani等[23]在農(nóng)藥草甘膦對翠鱧(Channapunctatus)的毒性研究中得到的結(jié)果相似，草甘膦暴露引起的血細(xì)胞DNA損傷存在明顯的時間劑量效應(yīng)，隨著藥物含量升高和暴露時間延長，DNA損傷加重。

此外，Olive尾距與暴露時間回歸分析表明，0.20 μg/L組線性關(guān)系較好，而0.10 μg/L組線性關(guān)系最差。有研究指出，低含量毒物條件下機(jī)體DNA損傷后修復(fù)能力強(qiáng)于高含量條件[24]。本研究結(jié)果也證實了該結(jié)論。在低質(zhì)量濃度條件下，中華絨螯蟹血細(xì)胞DNA修復(fù)能力更強(qiáng)，從而隨著試驗時間的推移其損傷程度和暴露時間之間的線性相關(guān)性降低。高含量多氯聯(lián)苯下櫛孔扇貝血細(xì)胞損傷較低含量有更強(qiáng)的恢復(fù)，推斷高含量污染物可以愈發(fā)地激發(fā)機(jī)體DNA的自我修復(fù)[21]。這可能是本試驗中0.40 μg/L組Olive尾距與時間的線性關(guān)系低于0.20 μg/L組的原因。

溴氰菊酯在農(nóng)業(yè)、漁業(yè)生產(chǎn)中被大量使用后，直接或間接進(jìn)入養(yǎng)殖水體。由于生產(chǎn)過程中施藥劑量較低，降解迅速，且經(jīng)試驗觀察發(fā)現(xiàn)，低于安全質(zhì)量濃度溴氰菊酯暴露下，中華絨螯蟹不會出現(xiàn)明顯的應(yīng)激行為和死亡現(xiàn)象，因此在生產(chǎn)過程中其對中華絨螯蟹的毒性影響易被忽視。但經(jīng)本試驗證實，溴氰菊酯對中華絨螯蟹血細(xì)胞有較強(qiáng)的遺傳毒性，即使在較低的安全質(zhì)量濃度下也可以在1 d內(nèi)造成其血細(xì)胞DNA出現(xiàn)損傷，因此筆者建議在生產(chǎn)中養(yǎng)殖水體及附近應(yīng)避免使用。彗星檢測可以有效地對溴氰菊酯在中華絨螯蟹遺傳毒性作用中進(jìn)行評估，拖尾率和Olive尾距是可以在檢測中使用的較為敏感的生物標(biāo)記。本研究將為后續(xù)菊酯類農(nóng)藥在淡水水生動物毒性作用的評估及環(huán)境毒理檢測提供理論依據(jù)。