TNF-α啟動子區單核苷酸多態性與中國維吾爾族白癜風的相關性

王曉朋 吳秀娟 趙宗峰 王 鵬 布瓦杰爾·亞克亞 普雄明 康曉靜

白癜風是一種難治性色素脫失性自身免疫性皮膚病，是皮膚黏膜內黑素細胞選擇性毀損所致。本病在世界范圍內發病率為0.5%～2%[1]，我國人群中發病率約0.5%[2]。近年研究發現，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)啟動區基因單核苷酸多態性與白癜風疾病易感性相關[3-5]，且不同人群中TNF-α啟動區多態性可能存在不同[6]。本研究為進一步探討白癜風發病機制中TNF-α基因啟動區單核苷酸多態性與中國維吾爾族人群白癜風相關性。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2011-2014年新疆維吾爾自治區人民醫院皮膚科維吾爾族白癜風患者316例，年齡(23.90±14.67)歲，男∶女為4∶5；維吾爾族健康對照組330例，年齡(25.25±11.18)歲，男∶女為3∶2。根據以下特點將白癜風患者分組：發病年齡(早發型：發病年齡≤20歲和遲發型：>20歲)；白癜風分型(局限型、散發型、泛發型、肢端型)；白癜風家族史(有和無)。經知情同意并簽字后抽取外周靜脈5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，放入-80℃冰箱中保存備用。所有白癜風患者的診斷標準按照中國中西醫結合學會皮膚性病專業委員會頒布的關于白癜風的診斷標準和疾病分期(2010年)[7]由兩位皮膚科醫生進行診斷，并排除其他可能導致色素減退的疾病如花斑癬、貧血痣、斑駁病、白化病、單純糠疹、老年性白斑等。健康對照組排除自身免疫性和系統性疾病的白癜風人群，同時要求均無白癜風家族史。本研究通過新疆自治區人民醫院醫學倫理委員會批準，所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和基因型DNA提取 用2.5%EDTA抗凝管取肘靜脈血1 mL。利用全血基因DNA提取試劑盒(TIANamp 北京鼎國生物技術有限公司合成)提取白癜風患者及健康對照組DNA。所得樣本-80℃保存。

1.2.2 聚合酶鏈反應(PCR) 用在線軟件primer3 input 設計合適長度488 bp且包含三個目的位點SNP的擴增引物(北京鼎國生物技術有限公司)，上游引物：5’-TCGATGAAGCCCAATAAACC-3’，下游引物：5’-TTTCATTCTGACCCGGAGAC-3’。PCR反應體系：總體積25 μL，包含1 μL引物混合液，2×Tap PCR Green Mix 12.5 μL，2 μL模板，9.5 μL去離子水。取5 μL PCR產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段長度，所有PCR產物均合格。PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性 30 s，60℃退火45 s，72℃ 延伸30 s，72℃再延伸 5 min，35個循環，最后4℃保存。

1.3 基因位點單核苷酸多態性(SNP)檢測 應用DNA測序法進行檢測。普通PCR擴增目的基因片段產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格。擴增產物送至上海生工公司測序，測序儀器為美國ABI3730型DNA 全自動測序儀完成測序并記錄結果。

1.4 統計學方法 所有數據采用SSPS 17.0軟件包進行分析。白癜風組和健康對照組定量資料計算用均數±標準差，采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律進行檢測。卡方檢驗(χ2)比較不同組別等位基因頻率及基因型頻率，相對危險度用比值比(OR)以及95%可信區間(95%CI)來評價，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α SNP的基因型及等位基因在兩組的分布 各組TNF-α基因三種位點九種基因型及等位基因在維吾爾族白癜風患者和正常對照組的分布，見表1。維吾爾族白癜風和對照組TNF-α rs1799964、TNF-α rs1800630、TNF-α rs1799724-基因型和等位基因比較均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 TNF-α SNP在白癜風組臨床表型的分布 TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724的基因型、等位基因在維吾爾族白癜風患者臨床表型(性別、年齡、分型、家族史)進行分層比較所得χ2值、P值、OR(95%可信區間)分布，見表2、表3。白癜風患者TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724基因型和等位基因頻率在性別均無明顯差異(P>0.05)。TNF-α rs1799724基因型頻率在早發型、局限型及有家族史的患者顯著高于遲發型其他三種類型(散發型、泛發型、肢端型)及無家族史的患者，均有統計學意義(均P<0.05)，TNF-α rs1799724等位基因頻率在有家族史的患者與無家族史的患者比較顯示有顯著差異(OR=4.269，95%CI:1.822～9.999)。

表1 TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724基因型及等位基因在兩組的分布

注：(G)代表基因型，(A)代表等位基因；rs1799964、rs1800630、rs1799724(基因型及等位基因頻率在維吾爾族白癜風組與對照組比較，均P>0.05)

表2 TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724基因型與維吾爾族白癜風臨床表型的分布

表3 TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724等位基因與維吾爾族白癜風臨床表型的分布

3 討論

細胞因子是一種重要的免疫調節物質，細胞因子網絡的不平衡甚至缺陷會引起免疫功能的不同反應，因此，細胞因子網絡可能很大程度上決定了自身免疫疾病的易感性與嚴重性。TNF-α是一種多功能的重要細胞因子，表達于巨噬細胞、T淋巴細胞、成纖維細胞和角質形成細胞，在預防感染、檢測腫瘤和炎癥的刺激反應中起廣泛的生物學效應。表皮黑素細胞單元由黑素細胞和32個角質形成細胞組成。TNF-α[8]作為角質形成細胞旁分泌細胞因子，可誘導黑素細胞表面ICAM-1和IFN-r的表達和啟動細胞凋亡而導致黑素細胞死亡，顯著抑制黑素細胞增殖及降低酪氨酸酶活性，但具體通過什么通路和機制有待進一步研究。相關研究顯示，TNF-α在尋常型白癜風患者血清、皮損水平顯著高于健康人群，且進展期呈現最高值。同時，TNF-α[9]拮抗劑通過抑制黑素細胞特異細胞毒性T細胞對黑素細胞的破壞進而阻止進展期白癜風患者色素進一步脫失，故TNF-α在白癜風發病過程中扮演重要角色。

TNF基因位點位于人類6號染色體上21區3帶6p(6p21.31)主要組織相容性復合體(MHC)III類區域內，長約3Kb，包含4個外顯子和3個內含子。在TNF基因5’末端調控序列在轉錄與反轉錄水平上監管TNF-α的生成，并且TNF-α基因多態性在不同種族中存在差異[10-12]，而這些差異可能導致相關疾病的發病、進展及預后在不同民族存在差異[13,14]。目前研究最多的五個位點：rs361525G/A、rs1800629A/G、rs1799724C/T、rs1800630C/A和rs1799964T/C。TNF-α啟動區基因多態性與糖尿病、甲狀腺疾病、痤瘡、強直性脊柱炎、系統性紅斑狼瘡等多種疾病易感性相關，但國內TNF-α rs1799724、rs1800630和rs1799964與白癜風相關性的尚未見報道。2006年，對61個土耳其白癜風的研究首次報道TNF-α rs1800629G/A與白癜風患者易感性無明顯相關性[4]。而2009年，通過對176個伊朗白癜風患者的研究認為，TNF-α rs1800629G/A在女性白癜風患者與對照組有差異性，在男性白癜風患者與對照亞類之間無差異性[3]。Laddha等[5]研究發現，TNF-α啟動區rs361525、rs1800629、rs1799724、rs1800630、rs1799964基因多態性的基因型和等位基因在泛發型或局限型白癜風患者均處于高表達水平與健康對照相比，且rs361525、rs1800629、rs1799724、和rs1799964多態性可提高白癜風患者血清中TNF-α的轉錄和蛋白水平，而rs1800630-863多態性相反，暗示TNF-α啟動子區基因多態性與白癜風易感性相關。有趣的是，本研究發現rs1799724、rs1800630、rs1799964基因多態性的分布在白癜風患者和對照組之間無顯著差異；進一步分析rs1799724、rs1800630、rs1799964位點等位基因分布與白癜風患者臨床表現相關性表明，rs1799724等位基因T參與有家族史白癜風的發病。

rs1799724位點可與核轉錄因子-kB結合，該位點堿基的替換可阻礙與p50-p50二聚體的結合，從而減弱核轉移因子-kB在增強TNF-α活性的作用[15]。TNF-α的rs1799964位點存在堿基T

本研究通過對TNF-α啟動區rs1799724、rs1800630、rs1799964三個SNP進行分型研究，證實TNF-α rs1799724 T等位基因與中國維吾爾族白癜風的相關性，更進一步提示TNF-α在白癜風發病機制中發揮重要作用。但本研究尚有一些不足之處，第一，本研究基于單個基因多態性進行關聯研究，在龐大的基因網絡中相互非常廣泛和復雜，而基因多態性之間是否有交互作用尚未明確，那么這些遺傳變異與疾病發病機制的相關性是否會受到其它基因多態性的影響尚不能明確。第二，TNF-α啟動區基因多態性在白癜風發生發展過程中發揮的作用及發病機制尚不完全清楚，其與白癜風的可能相關性及作用機制疾病仍待更深入研究。