血清lncRNA CRNDE對(duì)晚期結(jié)直腸癌一線FOLFOX方案化療療效和預(yù)后的預(yù)測(cè)作用

李玉霞，黃文偉，劉俊，熊芹

漢川市人民醫(yī)院腫瘤科，湖北 漢川432300

結(jié)直腸癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，隨著多學(xué)科團(tuán)隊(duì)的建立和治療模式的逐步成熟和完善，其病死率在多個(gè)國(guó)家均有下降[1]。目前5-氟尿嘧啶（5-Fu）仍是結(jié)直腸癌化療的基本用藥，以5-Fu為主藥的奧沙利鉑聯(lián)合5-Fu和亞葉酸鈣（FOLFOX方案）可使轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的中位生存時(shí)間由8個(gè)月延長(zhǎng)至16.2～19.5個(gè)月[2]。但晚期結(jié)直腸癌一線FOLFOX方案化療的總體有效率約為70%，如何在治療初始篩選出對(duì)一線FOLFOX方案化療可能無(wú)效的患者，進(jìn)行化療方案的調(diào)整和個(gè)體化的治療顯得極為迫切[3]。目前，長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在多種惡性腫瘤中存在差異表達(dá)，在各種腫瘤的早期診斷、預(yù)后和療效預(yù)測(cè)方面已進(jìn)行了廣泛的研究[4-5]。研究表明，部分lncRNA如GAS5[6]、TINCR[7]在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制已獲得了初步的探索，但目前尚缺乏針對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌FOLFOX方案治療的無(wú)創(chuàng)性療效預(yù)測(cè)的研究。本研究通過(guò)對(duì)晚期結(jié)直腸癌患者的血清lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選出潛在的預(yù)測(cè)一線FOLFOX方案療效的差異lncRNA，并從中挑選出結(jié)直腸腫瘤差異表達(dá)基因（colorectal neoplasia differentially expressed，CRNDE），進(jìn)一步探討CRNDE對(duì)晚期結(jié)直腸癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，最后對(duì)CRNDE的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)靶基因功能進(jìn)行分析，旨在探索晚期結(jié)直腸癌的新型預(yù)后標(biāo)志物，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2011年1月于漢川市人民醫(yī)院就診的7例晚期結(jié)直腸癌患者的臨床資料，根據(jù)其對(duì)一線FOLFOX方案化療的療效分為兩組（反應(yīng)良好組和反應(yīng)不良組）。腫瘤初次評(píng)估指運(yùn)用FOLFOX方案化療3個(gè)周期后，于初始治療開始后第2個(gè)月進(jìn)行療效評(píng)估。根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）進(jìn)行療效評(píng)估。其中，完全緩解（CR）為未檢測(cè)到腫瘤病灶；部分緩解（PR），所有可測(cè)量的腫瘤最長(zhǎng)徑之和縮小30%以上；疾病穩(wěn)定（SD），介于PR和疾病進(jìn)展（PD）之間；PD，所有可測(cè)量的腫瘤最長(zhǎng)徑之和增大超過(guò)20%。其中反應(yīng)良好組患者（CR+PR）4例，反應(yīng)不良組患者（SD+PD）3例。搜集治療前患者的血清樣本，對(duì)兩組患者的血清樣本進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析，篩選差異表達(dá)的lncRNA，選擇CRNDE進(jìn)一步分析。回顧性分析2011年2月至2013年2月于漢川市人民醫(yī)院就診的74例晚期結(jié)直腸癌患者的臨床資料，分析血清CRNDE表達(dá)水平與晚期結(jié)直腸癌患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。最后通過(guò)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)CRNDE的靶基因，并對(duì)靶基因進(jìn)行信號(hào)通路分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：①既往無(wú)其他惡性腫瘤史；②既往未行任何全身放療；③未合并同時(shí)性多源癌。術(shù)后2年內(nèi)，每3個(gè)月隨訪1次，術(shù)后第3～5年，每6個(gè)月隨訪1次，之后每年隨訪1次。

1.2 試劑和設(shè)備

Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Nano-Drop 2000分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，PrimeScript RT reagent Kit和 SYBR Premix Ex-TaqⅡKit均購(gòu)自日本Takara公司，Agilent Human lncRNA Microarray 4×180k芯片購(gòu)自美國(guó)安捷倫公司。

1.3 RNA提取、lncRNA芯片檢測(cè)、CRNDE的qRT-PCR檢測(cè)

抽取清晨空腹外周血5 ml置于離心管，37℃恒溫培養(yǎng)箱斜置2 h，4℃斜置4 h，析出血清移至離心管中。4℃下3197 r/min離心10 min，吸取上清1.5 ml。4℃下5055 r/min離心10 min，吸取上清轉(zhuǎn)至1.5 ml離心管中，-80℃保存。按照Trizol試劑盒說(shuō)明書提取血清樣本總RNA，定量測(cè)定RNA濃度和純度。當(dāng)吸光度（A260/A280）為1.9～2.1時(shí)，認(rèn)為RNA的純度較高，可用于下一步分析。lncRNA芯片檢測(cè)由上海歐易生物科技有限公司完成，差異lncRAN的標(biāo)準(zhǔn)為反應(yīng)良好組與反應(yīng)不良組表達(dá)相差1.2倍以上且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步挑選CRNDE進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）驗(yàn)證，根據(jù) PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix ExTaqⅡ Kit說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄提取RNA后進(jìn)行qRT-PCR，以18S rRNA為內(nèi)參。

1.4 lncRNA靶基因預(yù)測(cè)與信號(hào)通路分析

運(yùn)用MEM-Multi Experiment Matrix在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行CRNDE的靶基因預(yù)測(cè)，并運(yùn)用FunRich軟件對(duì)CRNDE的靶基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行信號(hào)通路分析[8]，探討CRNDE的生物學(xué)功能。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC），評(píng)價(jià)血清CRNDE對(duì)晚期結(jié)直腸癌一線FOLFOX方案療效的預(yù)測(cè)價(jià)值。采用X-tile 3.6.1軟件進(jìn)行CRNDE的截點(diǎn)設(shè)置，并根據(jù)設(shè)置的截點(diǎn)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異lncRNA的篩選

2011年1 月就診的7例患者中，4例患者反應(yīng)良好，3例患者反應(yīng)不良，對(duì)其血清lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，共篩選出356個(gè)差異表達(dá)的lncRNA；其中，反應(yīng)良好組上調(diào)lncRNA共125個(gè)，下調(diào)lncRNA共231個(gè)。由于CRNDE的P值最小，篩選CRNDE進(jìn)一步分析。（表1）

表1 反應(yīng)良好組和反應(yīng)不良組患者的差異lncRNA（ P值前 5名）

2.2 CRNDE對(duì)療效的預(yù)測(cè)價(jià)值

2011年2 月至2013年2月就診的74例晚期結(jié)直腸癌患者中，反應(yīng)良好者43例，反應(yīng)不良者31例。ROC曲線分析顯示，血清CRNDE預(yù)測(cè)晚期結(jié)直腸癌一線FOLFOX方案化療療效的AUC為0.691（95%CI：0.562～0.819），P=0.005。（圖1）

圖1 血清CRNDE預(yù)測(cè)晚期結(jié)直腸癌一線FOLFOX方案化療療效的ROC曲線

2.3 CRNDE對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

以5年總生存率為終點(diǎn)結(jié)局事件，運(yùn)用X-tile軟件對(duì)CRNDE的表達(dá)水平進(jìn)行截點(diǎn)設(shè)置。結(jié)果提示，CRNDE相對(duì)表達(dá)量=6.6為最佳分組截點(diǎn)，進(jìn)一步以6.6為截點(diǎn)分為CRNDE高表達(dá)組（n=8）和CRNDE低表達(dá)組（n=66）。對(duì)兩組患者的總生存率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，CRNDE高表達(dá)組患者的5年總生存率低于CRNDE低表達(dá)組（0 vs 31%），CRNDE高表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間為9.7個(gè)月（95%CI：7.0～11.2），明顯短于低表達(dá)組的36.0個(gè)月（95%CI：24.4～40.0），差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（χ2=23.504，P=0.001）。（圖2、圖3）

圖2 X-tile軟件對(duì)CRNDE表達(dá)水平的截點(diǎn)設(shè)置

圖3 CRNDE高表達(dá)組與低表達(dá)組結(jié)直腸癌患者的生存曲線

2.4 血清 CRNDE表達(dá)水平與晚期結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系

對(duì)CRNDE高表達(dá)組和CRNDE低表達(dá)組患者的臨床特征進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，不同性別、年齡、腫瘤部位、初始肝轉(zhuǎn)移數(shù)目的晚期結(jié)直腸癌患者的CRNDE表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而CRNDE低表達(dá)組患者的反應(yīng)良好率高于CRNDE高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.044）。（表2）

表2 血清CRNDE表達(dá)水平與晚期結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系

2.5 CRNDE的靶基因預(yù)測(cè)

應(yīng)用MEM-Multi Experiment Matrix在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行CRNDE的靶基因預(yù)測(cè)，選取排名前50的靶基因，構(gòu)建靶基因數(shù)據(jù)集。運(yùn)用FunRich軟件對(duì)CRNDE的靶基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行信號(hào)通路分析，結(jié)果提示CRNDE的靶基因主要富集于單核苷酸替換途徑拆分AP位點(diǎn)（resolution of AP sites via the singlenucleotide replacement pathway）和 5'→3'的 mRNA的降解外切（mRNA decay by 5'to 3'exoribonuclease）等信號(hào)通路上。（圖4）

圖4 CRNDE靶基因數(shù)據(jù)集的信號(hào)通路分析

3 討論

研究報(bào)道，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的5年生存率仍不足40%，即使使用了西妥昔單抗或貝伐珠單抗，也不能延長(zhǎng)其無(wú)進(jìn)展生存期[9]，而影響其長(zhǎng)期預(yù)后的主要因素為一線化療方案的療效[10]。因此，對(duì)一線全身化療方案的療效進(jìn)行精準(zhǔn)預(yù)測(cè)，有助于化療方案的選擇和個(gè)體化診療。有研究通過(guò)對(duì)CT參數(shù)進(jìn)行分析，構(gòu)建了能夠預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌對(duì)一線FOLFOX方案和伊立替康+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣（FOLFIRI方案）的化療預(yù)測(cè)模型，但該模型僅能在治療結(jié)束后或手術(shù)前使用，無(wú)法在初始治療時(shí)即預(yù)測(cè)其療效[10]。目前關(guān)于診斷性、療效預(yù)測(cè)性或具有預(yù)后價(jià)值的lncRNA被不斷發(fā)掘，并應(yīng)用于腫瘤的臨床研究中[11]。lncRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)RNA的表達(dá)、代謝和修飾，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制尚不明確[11]。Shen等[12]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA BANCR與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且其上調(diào)常提示不良預(yù)后。此外，lncRNA GAS5亦被證實(shí)與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。但既往研究多使用腫瘤組織樣本進(jìn)行l(wèi)ncRNA檢測(cè)。本研究首先對(duì)4例反應(yīng)良好和3例反應(yīng)不良結(jié)直腸癌患者的血清lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，從而對(duì)血清lncRNA進(jìn)行初篩。因本研究于所有全身治療前采集患者血液并檢測(cè)血清CRNDE水平，可用于療效預(yù)測(cè)，且為無(wú)創(chuàng)操作，有一定的臨床應(yīng)用前景。然后本研究進(jìn)一步選擇CRNDE進(jìn)行分析，結(jié)果提示CRNDE可預(yù)測(cè)晚期結(jié)直腸癌一線FOLFOX方案的療效，其AUC為0.691。

本研究通過(guò)血清qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，CRNDE低表達(dá)組患者的反應(yīng)良好率高于CRNDE高表達(dá)組，進(jìn)一步的生存分析亦提示CRNDE高表達(dá)組患者的預(yù)后不良。提示CRNDE表達(dá)上調(diào)不僅與腫瘤局部進(jìn)展有關(guān)，還與腫瘤對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方案化療的敏感性和生存率有關(guān)。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌中CRNDE可通過(guò)“吸附”miRNA-384，增加胰島素受體底物 1（insulin receptor substrate 1，IRS1）的表達(dá)，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。而在結(jié)直腸癌中，細(xì)胞水平研究提示，CRNDE可通過(guò)表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，沉默DUSP5/CDKN1A的表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[14]。但是CRNDE在結(jié)直腸癌耐藥方面的作用機(jī)制目前尚無(wú)研究?；诖?，本研究進(jìn)一步運(yùn)用生物信息學(xué)手段對(duì)CRNDE的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)這些靶基因進(jìn)行信號(hào)通路分析。結(jié)果提示，CRNDE可能通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA的降解和表達(dá)，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用，與前述的機(jī)制（增加IRS1表達(dá)、沉默DUSP5/CDKN1A表達(dá)）相符，為臨床耐藥靶標(biāo)的設(shè)計(jì)提供了參考。

綜上所述，血清CRNDE可作為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌一線FOLFOX方案療效預(yù)測(cè)的潛在無(wú)創(chuàng)血清標(biāo)志物，并與患者的預(yù)后相關(guān)。