雙相躁狂患者治療前后血漿microRNA-134及LIMK-1 mRNA的表達研究

徐丹 榮晗 劉鐵榜 趙杰 賴文濤

雙相情感障礙是以反復或交替的躁狂或抑郁發作為主要臨床特征的精神疾病, 伴有與異常心境相應的認知、行為、心理生理學以及人際關系方面的改變或紊亂［1-3］。雙相障礙是當今全球主要精神問題之一, 全球約有1億人遭受雙相障礙的困擾, 而中國估計也有幾千萬的雙相障礙患者［4,5］。雙相障礙造成沉重的疾病負擔, 患者承受殘疾、功能損害、生活質量下降、經濟負擔、治療風險、合并其他醫學疾患或自殺導致的死亡等結局［6,7］。目前以鋰鹽等抗癲癇藥物為主導的治療方法對部分雙相障礙患者有效, 且存在起效慢(數周到數月)、療效不完全、對部分患者無效、不良反應明顯的問題［8-10］。因此為雙相障礙尋找客觀的生物學標記物, 深入探索雙相障礙的發病機制, 將有助于降低誤診率, 準確評估患者病情和療效［7］。本研究旨在進一步擴大樣本觀察雙相躁狂患者血漿中microRNA-134及其靶蛋白LIMK-1的表達水平的改變及與雙相躁狂之間的關系?，F報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2010年8月~2012年8月在本院門診或病房接受治療的105例雙相躁狂患者為研究對象。納入標準:①符合DSM-Ⅳ的雙相障礙躁狂發作疾病診斷標準(至少2名副高及以上職稱的醫生進行診斷)；②BRMS評分≥11分；③ 年齡18~50歲。另選同期100例正常人為對照組, 均為深圳康寧醫院的職工或志愿者。排除標準：①合并心、腦、肝、腎等嚴重軀體疾病, 嚴重營養不良、肥胖等；②有內分泌系統、免疫系統、神經系統疾病, 急、慢性感染疾?。虎?個月內使用過免疫抑制劑及免疫增強劑, 電抽搐治療；④2周內服用過抗精神病藥物及心境穩定劑；⑤合并其他精神疾病和精神發育遲滯；⑥酒精或藥物濫用史；⑦懷孕、哺乳婦女及月經期女性；⑧血常規、肝臟生化、腎臟生化、心電圖、腦電圖及體格檢查結果有明顯異常；⑨近1年內有重大生活事件。患者組中男56例、女49例,平均年齡(35.49±8.31)歲, 平均首次發病年齡(19.36±5.36)歲, 平均病程(4.21±1.32)年, 平均情感障礙發作次數(2.76±5.74)次。對照組中男54例, 女46例, 平均年齡(34.89±7.45)歲。兩組年齡、性別等一般資料比較差異無統計學意義(P＞0.05), 具有可比性。本研究經深圳市康寧醫院倫理委員會批準, 兩組研究對象均自愿參加并簽署知情同意書。

1. 2 方法

1. 2. 1 治療方法 患者組藥物使用情況為：105例患者均使用鋰鹽治療, 藥物平均劑量為(1.0±0.2)mg；合并使用藥物為奧氮平, 藥物平均劑量(15.0±2.4)mg；使用藥物的時間為1個月。

1. 2. 2 樣本的采集與儲存 患者組在治療前和治療1個月后, 對照組在入組時分別采集空腹靜脈血6 ml, 經過3000 r/min離心15 min后收集血漿, 之后保存于-80℃冰箱。

1. 2. 3 實時定量PCR(Real-time PCR) Real-time PCR檢測血漿中microRNA-134及靶mRNA LIMK-1 mRNA表達水平：

圖1 兩組血漿microRNA-134表達水平比較

2. 3 患者組治療前后BRMS評分比較及與microRNA-134表達水平的相關性分析 患者組治療后BRMS評分為(9.8±3.9)分, 顯著低于治療前的(23.3±7.4)分, 差異有統計學意義 (t=16.5374,P＜0.05)。

對治療前和治療1個月后患者組的BRMS評分同血漿提取各組組織總RNA, 進行PCR檢測血漿中microRNA-134及靶mRNA LIMK-1 mRNA的表達, 每個樣品測3次, 把加好樣品的96孔板放在熒光定量PCR儀中進行反應, 反應條件如下: 95℃ 15 min后連續45個循環, 每個循環內95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 34 s, 總反應體積20 μl。本實驗用2-ΔΔCt值相對定量方法進行數據分析, ΔCt患者組= Ct患者組目標基因-Ct患者組內參；ΔCt對照組= Ct對照組目標基因-Ct對照組內參；ΔΔCt=ΔCt患者組-ΔCt對照組。ΔCt治療后= Ct治療后患者組目標基因-Ct治療后患者組內參；ΔCt治療前= Ct治療前患者組目標基因-Ct治療前患者組內參；ΔΔCt=ΔCt治療后-ΔCt治療前。2-ΔΔCt具有線性關系, 可用于最后數據的統計, 表示實驗組與對照組相對倍數關系。

1. 3 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。影響因素分析采用Pearson相關分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 兩組血漿microRNA-134表達水平比較 治療前, 患者組血漿microRNA-134表達水平(1.17±0.02)顯著低于對照組(1.46±0.04), 差異有統計學意義(P＜0.05)。治療1個月后,患者組血漿microRNA-134表達水平(1.36±0.07)較治療前顯著升高, 差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。

2. 2 兩組血漿LIMK-1 mRNA的表達水平比較 治療前, 患者組血漿LIMK-1 mRNA表達水平(0.37±0.02)均顯著低于對照組(0.46±0.01), 差異有統計學意義(P＜0.05)。治療1個月后, 患者組的血漿LIMK-1 mRNA表達水平(0.52±0.01)較治療前顯著升高, 差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。microRNA-134的表達水平進行相關分析發現：治療前患者組血漿microRNA-134表達水平與BRMS評分之間存在負相關(r=-0.48,P＜0.05)；治療1個月后患者組血漿microRNA-134表達水平與BRMS評分之間存在負相關(r=-0.39,P＜0.05)。見表1。

圖2 兩組血漿LIMK-1 mRNA的表達水平比較

表1 患者組治療前后BRMS評分和microRNA-134表達水平的相關性

3 討論

microRNA 是近年來發現的一類由約2個核苷酸組成的單鏈RNA, 在轉錄后水平負性調控基因的表達, 參與各種生理和病理活動［11-14］。關于microRNA與雙相障礙的關系, 目前國外Chen等［15］發現雙相障礙主要的治療藥物鋰鹽可以調節淋巴細胞系microRNA表達譜的變化, 間接表明microRNA與雙相障礙可能有關。而關于microRNA與雙相障礙的直接關系的研究極少, 僅限于尸腦研究, Kim等［16］、Moreau等［17］分別于 2010、2011年發現雙相障礙患者腦部的MicroRNA表達譜存在異常, 但可能由于尸腦組織保存條件等問題使研究結果不一致。

本實驗室于前期工作中發現, 雙相Ⅰ型躁狂發作的患者血漿microRNA-134 水平明顯變化, 且microRNA-134的表達水平與躁狂發作的嚴重程度負相關, 表明microRNA-134可能參與了雙相障礙的發病和治療［18］。有研究指出microRNA-134的靶蛋白LIMK-1參與了軸突的生長以及神經元再生等過程。而已經有研究發現樹突棘的生長, 神經元再生, 突觸和神經可塑性等參與了雙相障礙的發病基礎。LIMK-1是LIM家族中的一員, 是調控神經元細胞骨架肌動蛋白重塑的核心蛋白, 可影響樹突棘的形態, 促進神經元軸突和樹突的生長［19-22］。因此, microRNA-134可能通過調節其靶基因及靶蛋白LIMK-1而誘導了軸突的生長以及神經元再生等過程從而參與雙相障礙的發病。

本研究使用實時熒光定量-PCR技術同時對被試血漿中microRNA-134及 LIMK-1 mRNA表達水平進行了檢測, 發現患者組血漿microRNA-134及LIMK-1 mRNA表達水平均顯著低于對照組, 這表明雙相躁狂患者血漿microRNA-134及LIMK-1 mRNA的表達存在相應的變化, 提示血漿中血漿microRNA-134 及LIMK-1 mRNA的低表達與雙相障礙有關。

為了進一步驗證該結論, 在患者組治療1個月后再次評定BRMS評分, 發現治療后BRMS評分較治療前顯著降低,這表明治療后患者的病情比治療前明顯好轉。同時對患者組血漿microRNA-134及LIMK-1 mRNA表達水平檢測, 發現治療后患者組血漿microRNA-134及LIMK-1 mRNA表達水平較治療前顯著上升。這進一步證明了血漿中microRNA-134及LIMK-1 mRNA的表達趨勢的一致的變化與雙相躁狂的發作有關。說明microRNA-134可能通過調節其靶基因及靶蛋白LIMK-1而誘導了軸突的生長以及神經元再生等過程從而參與雙相障礙的發病。

綜上所述, 血漿microRNA-134及LIMK-1 mRNA的表達在雙相躁狂患者血漿中存在相應的變化, 可能可以聯合作為雙相躁狂的生物標記物, 然而具體的作用機制尚需進一步深入研究。