土壤中抗生素抗性基因的分布及遷移轉化

張 寧,李 淼,劉 翔 (清華大學環境學院,北京 100084)

抗生素被廣泛用于預防由細菌感染引起的人類疾病以及促進養殖場畜禽的生長[1-2],然而研究表明用于醫療或者動物養殖的抗生素約有30%～90%以原藥或者代謝物形式排出體[3],在環境中形成了一定積累[4],并對抗生素抗性的形成了選擇壓力,進而促進了抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes, ARGs)的產生和傳播.而ARGs的傳播引起的生態風險可能比抗生素更大.近年來,抗生素抗性作為一個重要的全球公共衛生問題受到越來越多的關注[5-6],并在2013年的 G8峰會上被確定為二十一世紀的主要衛生安全挑戰[7].

目前已發現有40種四環素類ARGs,4種磺胺類ARGs和10種β-內酰胺類ARGs.抗生素抗性微生物(Antibiotic Resistance Microorganisms,ARM)死亡后,攜帶ARGs的DNA釋放到環境中,在土壤礦物、有機膠體等的保護下可長期存在[8],不但可以通過水平基因轉移(Horizontal Gene Transfer, HGT)的方式進入到其他微生物菌體或環境中[9],甚至能轉移到人類共生微生物和病原體中[10].ARGs一旦產生就會在微生物種群中長期存在[11],可能對公共健康、食品和飲用水安全構成威脅,甚至出現無藥可醫的局面.

土壤被認為是抗生素殘留的最重要的受納體之一,抗生素殘留和ARGs主要是通過施肥、污泥農用[12]以及廢水或再生水灌溉[13]等方式釋放到土壤中.目前關于土壤中 ARGs的研究主要集中在農田土壤施用糞肥后土壤 ARGs的豐度變化,廢水灌溉后土壤ARGs的分布情況,以及外源匯入對土壤微生物的影響,并且多集中于少數種類的ARGs研究,而對于土壤物理、化學作用對ARGs的影響及ARGs在土壤中的遷移轉化研究尚處于起步階段,對于隨糞肥或者污水進入土壤的重金屬及其他物質對 ARGs的影響機制不明確.

事實上進入土壤的 ARGs不但可以通過植物吸收進入生物鏈,甚至還能通過滲漏進入地下水環境中,甚至很可能通過HGT以飲水與生物帶入食物鏈的方式,在各個環境介質中傳播轉移,最后會進入人體.因此對土壤中 ARGs分布和傳播的調查和深入研究刻不容緩.

1 土壤中ARGs的來源與分布

絕大多數用于治療的抗生素來源于土壤微生物群落,可以說土壤是ARGs的主要來源之一.研究證明土壤中的ARGs豐度高且具有多樣性,其來源分為本底存在和外源匯入兩類.土壤本底抗性是指土著抗生素抗性菌(Antibiotic Resistance Bacteria, ARB)的基因組上存在 ARGs的原型片段以及沒有表達的潛在ARGs片段;外源匯入是指受人類活動等因素的影響,由外源攜帶進入土壤環境.

1.1 土壤中ARGs的本底抗性

各種各樣的ARGs都可以找到攜帶的微生物,這些微生物居住在不受人類影響的各種生態環境中.D'Costa等[14]應用宏基因組學的方法研究了加拿大Dawson城市30,000年前的永久性凍土,分別檢測出了β-內酰胺類、四環素類和糖肽類ARGs的基因序列;Allen等[15]在未有人類活動的Alaskan土壤中發現了β-內酰胺抗性基因.研究人員對西藏地區沒有人為抗生素干擾的土壤,動物廢棄物和沉積物的分析也發現了不同類型的ARGs和可移動遺傳因子(Mobile Genetic Elements, MGEs),此外還發現西藏環境中的ARGs小部分由MGEs攜帶[16].對新墨西哥州被隔離了400萬年的Lechuguilla Cave中可培養微生物的研究也表明,這些微生物高度耐受抗生素,其中有些菌株甚至可耐受 14種不同的抗生素[17].都說明了早在抗生素廣泛應用前,土壤環境中就存在ARGs.

1.2 人類活動對土壤ARGs的影響

與相對原始的ARGs相比,自人類廣泛使用抗生素以來,當代人為干擾環境中的ARGs和MGEs已經發生了相當大的變化.

在抗生素被廣泛應用的 70a間,人類活動加速了 ARGs在土壤環境中的分布和傳播,主要可歸納為兩個方面:肥料施用以及廢水或再生水灌溉回用.城市生活污水和垃圾滲濾液由于受到人類生產生活的影響,被認為是抗生素殘留以及ARB的重要儲存庫[18].醫療廢水中殘留的抗生素對 ARGs的產生也具有一定的誘導作用,并且人類服用抗生素之后也有可能會在體內誘導出ARB,這些ARB同樣會隨糞便排入醫療廢水,因而大大增加了醫療廢水中ARGs的豐度[19].不論是城市生活污水還是養殖場廢水,或者醫療廢水,最后都會進入污水處理廠,然而研究發現污水處理廠現行的處理工藝對抗生素及ARGs的去除效果并不高[20],經過處理之后的再生水通過回灌進入土壤.另外畜禽糞便、剩余污泥還可以通過堆肥,以肥料的方式進入土壤,造成土壤中抗生素和ARGs的累積.

對美國Cache La Poudre River五個不同污染程度的區域(無污染區、輕型農業活動污染區、城市污水排放區、農業活動嚴重污染區、城市和農業混合污染區)的抗生素抗性表型及ARGs的研究結果發現受人類干擾區域的四環素類及磺胺類 ARGs水平明顯高于未受干擾區域[21].

1.2.1 不同來源ARGs對土壤ARGs的影響 養殖場由于長期使用抗生素作為飼料添加劑以及預防畜禽疾病,其畜禽糞中ARGs種類多種多樣,有人對國內3個大型養殖場的取樣測試發現場地土壤中有149種ARGs被檢出[22],因此畜禽糞的處理和處置均能影響土壤中抗性水平.

多項研究表明,豬糞肥的施用顯著提高了土壤微生物對四環素和磺胺類抗生素的抗性[23-25].對北京 9個長期施用畜禽糞肥的蔬菜生產基地土壤樣品的檢測也發現,四環素、氨芐西林、環丙沙星以及磺胺甲惡唑耐藥菌比例遠高于不施肥土壤,且施肥土壤中sul1和sul2以及tetL的檢出率為100%[26].可能是因為磺胺類和四環素類抗生素是養殖業中常用的抗生素種類,而我國獸藥抗生素中四環素的生產和使用比例最大[27].畜禽糞肥的施用還可能引起土壤微生物特定種群豐度的增加[28].對施用豬糞肥的玉米根際和非根際土壤的微生物群落檢測發現,根際土壤中sul1和sul2豐度比非根際土壤中豐度低1～2個數量級[29],圖1總結了糞肥施用對土壤及根際群落結構的影響[30].

然而也研究發現糞肥施用導致的土壤 ARGs增加不會長期維持,施用豬糞肥的土壤在21d和6個月后分別對磺胺氯噠嗪和四環素的抗性回到原始水平[23-24].但是來自糞便細菌的ARGs通常位于整合子,轉座子和插入序列等元件上,這些元件可以通過廣宿主質粒等接合元件有效地轉移到土壤細菌中[31],從而引起土壤中ARGs豐度的增加.目前多數研究都集中于施用糞肥前后土壤微生物的監控而很少有研究指出施肥過程、土壤質地、土壤動物以及種植的作物種類對ARGs豐度變化的影響.

污灌對于土壤中的ARB和ARGs的影響也多有報道,對北京和天津的5個污灌區的污水灌溉和非灌溉土壤的抗生素、ARB以及ARGs豐度進行檢測,發現污灌土壤中抗生素的濃度和 ARGs的豐度顯著增加[7].對不同灌溉方式下不同性質土壤中 ARB和ARGs的豐度變化研究表明,使用再生水灌溉的土壤要比清水灌溉的土壤有著更高的抗性水平[32].

以畜禽養殖廢水為例,其中ARGs的分布表現為tetQ、tetM、tetW、tetO的檢出頻率和豐度均高于其他類型的四環素類ARGs,其次為sul1、sul2和sulA[33].現有關于污水灌溉對土壤 ARGs的影響研究也多集中于少數幾種常見的四環素和磺胺類 ARGs的變化而對于長期利用再生水灌溉引起的土壤中 ARB和ARGs變化的研究較少,關于再生水灌溉對根際土壤和非根際土壤中ARGs的研究還未知,事實上再生水回灌可能是ARGs進入土壤的重要途徑之一.

圖1 糞肥施用對土壤和根際微生物群落結構和功能的影響[30]Fig.1 Effects of manure that contains antibiotics on the structure and function of bacterial communities in soil and rhizosphere

表1 不同國家地區土壤ARGs或ARB的存在狀況Table 1 Distribution of ARGs & ARB in different countries and regions

除此之外,土壤環境中質粒和其他 MGEs的穩定 性受到土壤類型,土壤養分,濕度,溫度,以及pH值等的影響[34-35].因此在考察外源匯入對土壤 ARGs的影響過程中,多種因素的聯合作用需要更加深入的研究.1.2.2 不同土壤類型中ARGs的分布 目前,在不同國家和地區的不同土壤樣品中均有ARB及ARGs的檢出報道,不但包括養殖場內部土壤,施用糞肥的土壤以及污水灌溉土壤,還包括各類河流表層土,沖積土以及未施肥的農田種植土.下表中列出了各類土壤中ARB和ARGs的存在情況.

2 ARGs在土壤環境中的轉移傳播

ARGs作為一種新型污染物,其在環境中的傳播擴散受到越來越多研究者的關注,因此在評估土壤ARGs的生態影響時,不應該忽視外源 ARGs在土壤環境中的擴散以及其在種內和物種間水平上的基因交換.

圖2 外源ARGs進入土壤環境甚至人體的途徑Fig.2 The way of exogenous ARGs entering into soil environment and even human body

如前所述,生產生活廢污水都會進入污水處理廠,經過處理之后再排入環境中,進入環境中的ARGs可以在各介質中傳播擴散,并最終進入到土壤環境中,并有可能通過食物鏈進入人體,如圖2所示.

2.2 土壤中ARGs的轉移傳播

ARGs在土壤中的傳播是一個復雜的過程,ARGs不僅可以通過物理方式在空間上傳播,如:風力,水流等自然外力;蚯蚓,線蟲等土壤動物的攜帶等都為ARGs的傳播提供了便利的條件[39];而且還能通過遺傳或基因轉移在微生物間轉移傳播,其方式包括基因垂向轉移(Vetical Gene Transfer, VGT)和水平轉移(HGT).VGT是指親代和子代之間,通過繁殖發生的基因轉移,傳播范圍有限.HGT是指在差異生物個體之間,或單個細胞內部細胞器之間所進行的遺傳物質的交流.其中差異生物個體可以是同種的但含有不同遺傳信息的生物個體也可以是不同種的生物個體[46].由于 HGT可以在同種或不同種屬的菌株間發生傳遞,因而大大加速了ARGs出現的幾率.攜帶ARGs的裸露DNA在一定的環境條件下能使ARGs轉移進入受體細胞,受體細胞中的遺傳物質又可以通過載體(如質粒)、直接(如接合)或者間接(如轉化)的形式進一步轉移[47],從而實現ARGs的擴散轉移.

轉化、轉導和接合被認為是 HGT的主要方式[48].如圖3所示,轉化依賴于質粒或者細胞死亡后主動外排的染色體DNA片段,并且需要一個具有攝取胞外DNA能力的受體,完整的轉化還依賴于受體的宿主細胞含有 DNA修復酶(重組酶),通過同源重組或者異常重組完成轉化過程.轉導是通過噬菌的作用轉移基因的過程,噬菌體在宿主體內自我復制的過程中可以將宿主的遺傳物質轉移到新的宿主體內,或者將噬菌體吸附位點附近的DNA轉移到新的宿主體內.接合的產生則是供體菌和受體菌通過抗性菌毛相互連接形成通道,DNA片段進入受體菌 的過程[49].

圖3 抗生素抗性基因水平轉移機制[48]Fig.3 The horizontal transfer mechanism of antibiotic resistance genes

2.2.1 土壤中ARGs的水平基因轉移 HGT被認為是ARGs在土壤中傳播擴散的主要原因,因為進入土壤的外源微生物并不能很好地適應新環境,然而HGT卻可以使得進入到土壤中 MGEs在土著微生物間轉移傳播,因而在土壤中長期存在.

目前關于ARGs在土壤中HGT的研究還主要集中于MGEs攜帶的ARGs的轉移.其中,抗生素抗性質粒被認為是ARGs水平轉移的重要載體元件,在土壤抗性傳播擴散中起到重要作用[50].通過基因組 DNA的PCR和雜交技術在豬糞中發現了81個質粒,并在這些質粒上檢測到了阿莫西林、磺胺類 ARGs[51].耐藥質粒通常通過接合或轉化的方式在土壤細菌間傳遞 ARGs.對含有綠色熒光蛋白標記的廣宿主質粒RP4供體菌在土壤細菌懸浮液中的轉移研究發現,ARGs的轉移率可達到1次/104土壤細菌轉移,能接受該種質粒ARGs的受體菌包括屬于α-變形菌,β-變形菌和γ-變形菌類的細菌變形菌[52].

轉化是ARGs轉移的另一個重要機制,其中轉座子具有廣宿主性,能在革蘭氏陰性菌和陽性菌之間傳播,既可以存在于質粒上又可以存在于染色體上.de Vries等[53]的研究表明,至少有87種細菌可以通過自然轉化吸收胞外游離的 DNA并發生水平轉移,包括假單胞菌和不動桿菌等菌屬.還有研究指出,ARGs可以在土壤微生物和農作物之間發生轉移[54].對 11個肉雞飼養場的多種 ARGs的檢測發現,磺胺類 ARGs在11個養殖場的所有樣品中均有檢出,并且sul1的濃度高于 sul2,可能是因為 sul1通常與整合子連接,較sul2有著更廣泛的宿主范圍[55].

《論語·泰伯》孔子云：“大哉堯之為君也！巍巍乎，唯天為大，唯堯則之。 蕩蕩乎，民無能名焉。 巍巍乎，其有成功也。 煥乎，其有文章。”[1]107 只有崇拜和贊頌。

另外ARGs也可以在土壤不同空間上發生轉移,通過連續灌水的飽和土柱研究 ARGs的遷移特征以及轉化效率發現,位于質粒pLEP01上的ARGs降解程度與其在土柱中的停留時間成正比,對 DNA的生物活性的測試表明,該活性與其降解后的剩余 DNA大致成比例,也就是說ARGs可以在水分飽和的土壤中運輸相當長的距離[56].通過質粒在多孔介質填充柱的轉移研究發現土著抗性質粒 pK5和工程質粒pBR322的轉移運輸過程類似,土壤中的土著質粒有可能長距離運輸并導致抗生素抗性的擴散[57].

另外,養豬場附近典型土壤的土著細菌中發現了tetM,也表明了 ARGs有可能通過動物腸道菌株向土壤微生物傳播[58].

2.2.2 土壤對攜帶ARGs的裸露DNA的吸附 攜帶ARGs細菌自身的代謝也是 ARGs轉移的主要方式,ARB死亡后,細胞裂解將體內的抗性DNA分子釋放到土壤,裸露的 DNA分子在環境中的持久性暴露也可能導致ARGs的水平轉移[59],如圖4所示.

DNA分子能夠被土壤生物活性組分(土壤膠體)或者土壤粘土顆粒吸附,因此可以在一定程度上抵抗核酸的降解作用,有助于提高其在土壤中的轉化能力和水平轉移的頻率.

然而,不同類型的土壤性質對ARGs的吸附和保留也有很大同[60].對不同農田施用豬糞和污泥后tetO、tetW及sul1的豐度變化的研究發現,壤土中3種ARGs的豐度均有增加,沙壤土卻無明顯變化[61].

事實上,不同土壤類型或者土壤成分對 DNA的吸附作用也不一樣.在有機粘粒和蒙脫石上 DNA主要吸附的膠體表面上,靠靜電力控制,容易被解吸;而在無機粘粒和高嶺石上則通過配位交換和氫鍵連接,吸附在膠體邊緣,不易被解吸. DNA在棕壤有機粘粒和蒙脫石表面對核酸酶有較強的抗性,而無機粘粒和高嶺石表面固定的 DNA容易被降解,可變電荷的紅壤中有機質和顆粒大小對 DNA降解的影響并不顯著[62].說明吸附的 DNA抗核酸酶降解的能力不受DNA分子對膠體的吸附親和力的控制.

圖4 土壤環境中質粒的存在形式[59]Fig.4 The form of plasmid in soil environment

另外,環境pH值也可以影響土壤顆粒對DNA的吸附,pH從2.0上升到5.0,DNA在土壤膠體和礦物表面的吸附量明顯降低,從 5.0到 9.0,吸附量緩慢降低;DNA分子在蒙脫石、高嶺石和針鐵礦上的吸附焓變隨pH值的增加而增加,隨著MgCl2濃度的增加而降低[63].

由于不同種類ARGs與土壤組分作用各不相同,并且土壤環境復雜,目前很難清晰地說明土壤理化特性對ARGs的影響,有待今后的深入研究.

3 影響ARGs在土壤中傳播的因素

研究證明影響 ARGs在環境中傳播轉移的因素主要分為兩個方面,一個是抗生素殘留水平所產生的選擇壓力,另一方面是環境條件,主要包括光照、溫度、pH值、重金屬、有機物質等.

3.1 抗生素

一般認為,抗生素的使用和處置對ARGs以及傳播具有一定的選擇壓力[64].抗生素自身在環境中的分布、遷移在很大程度上與其所誘導的 ARGs具有一致性,其濃度與ARGs的相對豐度之間存在一定的相關性[21,65],環境中抗生素的濃度大于最小抑制濃度(MIC)時,即被認為是強選擇壓力.亞治療濃度的抗生素(通常為MIC的幾百倍)水平也可以使環境中ARB增殖,可見抗生素殘留是環境中 ARB繁殖和傳播的重要原因.

3.2 重金屬

大量研究表明,介質中重金屬的存在對ARGs的誘導和激發也起到一定作用.通過研究豬糞、施肥土壤及對照土壤中8種ARGs,7種重金屬及6種抗生素的存在水平,發現一些ARGs與某些重金屬之間存在顯著相關性,如sul3,sulA與銅、鋅、汞之間的相關性系數均在 0.8以上[66].也有研究發現用硫酸銅處理過的土壤中的 ARM 顯著增加[67],在實驗室條件下研究Zn對鎮江桑樹圃的土壤ARGs水平基因轉移的影響發現高濃度的Zn可以促進氨基糖苷類ARGs與轉座子和整合子豐度的上升,有利于MGEs介導的ARGs發生轉移[68].都說明了重金屬對ARGs的產生及傳播有共選擇性作用.

3.3 有機物

除了抗生素、重金屬之外,還有很多有機物質被認為是ARGs的誘導因子,這些物質多數有抗生劑的功效,被廣泛地應用于農藥和個人護理品,在環境中的檢出量高出抗生素幾個數量級,有可能成為 ARGs的潛在誘導因子[69].

另外,研究發現離子液體 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([BMIm][PF6])可以通過抑制基因 korA、korB和 trbA的 mRNA表達水平來提高大腸桿菌E.coli DH5α的同屬和跨屬的接合轉移,并通過增強kilA和kilB的mRNA的表達水平抑制垂向轉移[70].

3.4 其他環境因素的影響

一些環境因素也成為ARGs轉移的驅動力,如土壤含水量,環境溫度,pH,離子強度等.

以色列再生水滴灌場地研究發現直接滴灌點的土壤中ARGs明顯高于 50cm遠的土壤,推測含水率較高的土壤中有較高的微生物活性,促進了ARGs的水平轉移過程[32].Trevors 等[71]發現培養基中的R質粒在30℃和22℃時,發生了轉移,但在15℃時,未發生轉移.說明溫度會影響質粒的轉移過程.另外,二價離子相較于一價離子更能促進DNA在土壤礦物表面的吸附[63].

此外環境中的營養元素(如碳源、氮、磷等)對ARGs的轉移也有顯著影響.添加葡萄糖、α-乳糖能將城市污水中ARGs的水平轉移頻率提高了1-4個數量級,而添加氮和磷也能顯著提高轉化結合子的數量[72].

4 結語

我國作為抗生素的生產和使用大國,環境中ARGs的污染不容忽視.ARB和ARGs不但可以隨施肥或者入滲進入土壤,通過 HGT在不同物種及環境間轉移.而且隨著微生物的不斷進化,新的抗生素抗性機制也可能會隨之產生[66].ARGs在土壤中的分布特征、行為機理及傳播擴散等研究工作尚處于起步階段.目前不僅對隨肥料施入土壤的外源ARGs對土壤ARGs的影響作用機制不明確[67],而且土壤理化特性對ARGs賦存的影響也不清楚,因此對土壤中ARB和ARGs的分布規律及轉移傳播特性亟需深入研究.

(1)開展典型污染場地定點調查,全面掌握 ARGs的分布規律,污染程度,追蹤污染源,為 ARGs環境污染評價指標提供相應的數據參考,為建立相應的環境標準提供理論依據.

(2)從前期預防,過程控制和末端治理同時入手深入研究ARGs在不同土壤環境中的遷移轉化規律,以及影響其遷移轉化的環境因素,探討ARGs轉移傳播過程中的關鍵制約因子,建立相應的數量關系,為預測和防治土壤ARGs污染提供科學的基礎數據.

(3)積極開展ARGs環境污染風險評價工作,開展ARGs的生態毒理研究,建立完善的 ARGs安全評估系統,對保障人類健康和生態環境安全具有重要的現實意義.