Shewanella oneidensis MR-1對Cr(VI)的還原及其影響因素

杜艷影,劉小紅,2,李 勁,李磊明,司友斌* (.農田生態保育與污染防控安徽省重點實驗室,安徽農業大學資源與環境學院,安徽 合肥 230036；2.中國科學院南京土壤研究所土壤環境與污染修復重點實驗室,江蘇 南京 20008)

環境中Cr主要以Cr(III)和Cr(VI)形式存在,前者低毒[1],且能在中性條件下與氫氧化物生成沉淀而得以去除;而Cr(VI)具有劇毒且易溶于水,容易在水體中遷移轉化和生物富集,濃度較高時能造成人體皮膚潰爛、眼睛刺痛和消化道粘膜損傷等,低濃度時也會有致癌、致畸、致突變效應,對人類健康和環境造成嚴重的影響.Cr(VI)的處理通常采用還原中和、離子交換、鉻酸鋇沉淀等方法[2].近年來,也有報道利用生物材料吸附法去除水中 Cr(VI)[3].但這些方法都有污染大、難回收、易造成二次污染等特點.目前研究發現許多微生物對 Cr(VI)具有很強的抗性,并能在好氧或厭氧狀態下將 Cr(VI)轉化為毒性較低的 Cr(III)[4].由于細菌在生長過程中不斷進行繁殖,因此在代謝活動中可不斷將 Cr(VI)還原為 Cr(III),而不會出現反應飽和現象.另外,生物法設備簡單,投資少[5],在 Cr(VI)去除方面值得推廣.微生物還原 Cr(VI)的機制目前也是研究的熱點.

Shewanella oneidensis MR-1屬于革蘭氏陰性兼性厭氧細菌,適宜生長溫度30℃,在培養皿中經48h培養形成圓形、橘黃色、無光澤、表面光滑、邊緣規則的菌落[6].S. oneidensis MR-1屬于典型鐵還原菌,使重金屬還原,從而起到解毒作用[7].而微生物通過自身的生理活動直接將 Cr(VI)還原為 Cr(III),被普遍認為是酶促反應過程,即為生物體內某些還原酶的還原作用,這些酶通稱為 Cr(VI)還原酶[8].研究發現 S.oneidensis MR-1可在20min內將100mmol/L的Cr(VI)還原為 Cr(III),而且鉻酸鹽的增加對菌體生長無影響[9].此外,發現腐敗希瓦氏菌 S. putrefaciens MR-1[10]、認為蒼白桿菌Ochrobactrum sp.[11]都可將Cr(VI)還原為 Cr(III).對于其還原機理,研究發現 S.putrefaciens MR-1對鉻還原后的沉淀在細胞內和細胞外都存在,但是未確定沉淀的化學形態[12].S.oneidensis MR-1在以甲烷為碳源條件下對水鐵礦的還原率很低[13].關于微生物對 Cr(VI)還原的機理研究一直都頗具爭議.本文主要研究S. oneidensis MR-1對 Cr(VI)還原作用及其影響因素,并且采用 SEMEDS、XPS等方法進行表征.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

重鉻酸鉀(K2Cr2O7,純度≥99.8%);鉻儲備液(500mg/L)于4℃冰箱保存;鐵儲備液(100mg/L)于4℃冰箱保存;二苯碳酰二肼、丙酮、硫酸、硫酸亞鐵銨、鹽酸羥胺、鄰菲啰啉、冰醋酸、三氯化鐵、無水乙醇、鹽酸均為分析純.

菌種來源:S. oneidensis MR-1由西北農林科技大學土壤微生物實驗室提供.

菌懸液的配制主要采用 LB培養基,后期試驗所用培養基為S. oneidensis MR-1專性培養基.

LB富集培養基(g/L):牛肉膏 5.0,蛋白胨 10.0,NaCl 5.0,pH值調至7.0左右;固體培養基再按1.5%～2.0%的比例加入瓊脂粉,121℃滅菌30min[7].

S.oneidensis MR-1專性培養基(g/L):KH2PO4·7H2O 3.0、Na2HPO4·7H2O 12.8、NH4Cl 1.0、NaAc 2.0、酵母抽提物2.0[7].

菌懸液的制備:在無菌條件下,將保存的 S.oneidensis MR-1接種到固體LB培養基中,恒溫30℃培養,經過24h培養生長,將S. oneidensis MR-1轉移到已滅菌的液體培養基中繼續恒溫培養.在液體 LB培養基中,30℃恒溫振蕩,搖菌轉速180r/min,經過24h培養進入對數生長期.

人工合成 Fe(OH)3的制備方法:稱取 38.07g FeCl3·6H2O 于 1L大燒杯中,加入去離子水 1000mL,攪拌使其溶解,滴加1mol/L NaOH溶液,控制pH值在7.0～7.6之間,可得紅褐色懸浮狀Fe(OH)3即為人工合成的 Fe(OH)3原液.人工合成的 Fe(OH)3具有比表面積大和活性高的特點.

1.2 實驗方法

將S. oneidensis MR-1菌懸液無菌操作接種至含有液體S. oneidensis MR-1專性培養基的血清瓶中,并添加 Cr(VI)溶液,充氮氣除氧,加蓋密封,置于 30℃搖床中 150r/min 振蕩培養,定期采集樣品,測定培養液及細胞中 Cr(VI)濃度變化.同時設置不添加 S.oneidensis MR-1菌懸液作為對照,每種處理3次重復.

菌株的厭氧培養:在超凈厭氧工作臺上,高純 N2通過一個裝有細菌過濾器的塑膠管充入裝有培養液的棕色瓶中.充氣15min后,快速擰緊瓶蓋密封后置于30℃恒溫培養箱中靜置培養.

影響因素的設置:分別調節液體培養基的 Cr(VI)濃度、接菌量,pH值,Fe(OH)3投加量.調節Cr(VI)濃度為0,5,10,20,30mg/L;接菌量的設置是將0.1,0.2,0.4mL S.oneidensis MR-1菌懸液接種至20mg/L的Cr(VI)液體培養基中,溶液總體積為 20mL;控制 pH 值為5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,Fe(OH)3濃度分別設置投加0,0.5,1,1.5mmol/L Fe(III)(以 Fe(OH)3形式).

樣品提取:樣品搖勻后取3組5mL懸濁液:一組稀釋5倍后用于測定OD值,并且轉換成細胞數[14];一組放入10mL離心管以4000r/min離心10min后,測定六價鉻的含量;一組用注射器將懸濁液吸出,用孔徑為0.45μm 濾膜過濾,收集濾液,放入 4℃冰箱保存,用于測定總鉻.

六價鉻測定:本實驗采用二苯碳酰二肼分光光度法測定Cr(VI)含量.

1.3 掃描電鏡能譜分析(SEM-EDS)

取培養好的S.oneidensis MR-1菌液, 1500r/min離心8min,棄去上清液.分別加入0.1moL/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2),1500r/min離心8min,棄去上清液,重復兩次.依次進行固定、漂洗、脫水、干燥后,取適量菌體粉末置于掃描電鏡(日立S-4800型)樣品臺上,鍍膜處理后對樣品進行觀察,并用掃描能譜(Model H-7650,Hitachi, Japan)對菌體進行成分分析[15].

1.4 X射線光電子能譜分析(XPS)

高性能 X射線光電子能譜(XPS)[16],儀器型號為Thermo ESCALAB 250,X射線激發源為單色Al Ka(hv =1486.6eV),功率 150W,X 射線束斑 500 μm,能量分析器固定透過能為30eV.

1.5 數據處理與分析

Cr(VI)還原率的計算方法:

式中:ω為 Cr(VI)的還原率,%;C0為初始 Cr(VI)的濃度,mg/L;Ct為T時刻Cr(VI)的濃度,mg/L.

相關數據分析用Excel和Origin 8.5軟件處理.

2 結果與討論

2.1 S. oneidensis MR-1的生長曲線及其對 Cr(VI)的還原

圖1 不同Cr(VI)濃度下S. oneidensis MR-1的生長曲線Fig.1 Growth curves of S. oneidensis MR-1at different concentrations of Cr(VI)

圖2 Cr(VI)初始濃度對S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的影響Fig.2 Effect of initial Cr(VI) concentration on Cr(VI) reduction by S. oneidensis MR-1

不同 Cr(VI)濃度會對微生物的生長及活性產生不同的影響,并表現為不同的Cr(VI)還原率.由圖1可見,在 30℃、pH 7.0條件下,未添加 Cr(VI)時,S.oneidensis MR-1生長較快,連續培養3d后,菌體濃度每 mL高達 1.2×108個.當添加不同濃度 Cr(VI)后,S.oneidensis MR-1的生長受到一定程度的抑制,其菌體濃度增長呈現不同程度的降低.隨著 Cr(VI)濃度的增大,Cr(VI)對菌株的毒性越強,當Cr(VI)濃度為30mg/L時,在培養 3d后菌體濃度每 mL僅為 2.01×107個,表明Cr(VI)濃度越高,對S. oneidensis MR-1生長的抑制越強.從圖2可知,Cr(VI)還原率隨著Cr(VI)初始濃度增大而顯著減小.Cr(VI)初始濃度為 5mg/L的處理組,Cr(VI)去除率在1d內便達到了95%,當Cr(VI)初始濃度為20mg/L,Cr(VI)還原率在18h內只達到25%,7d才達到88%.研究結果表明,初始Cr(VI)濃度對Cr(VI)還原率影響較大,Cr(VI)初始濃度在 20mg/L及以下時,Cr(VI)還原率隨反應時間增加較快,且最終基本可達到 100%;當 Cr(VI)初始濃度在 30mg/L,Cr(VI)還原率增加緩慢.由圖2可知,在相同反應時間內,Cr(VI)還原量隨 Cr(VI)初始濃度增大而呈減少趨勢.隨著反應進行,單位時間內Cr(VI)的去除量逐漸減少.這是因為,隨著 Cr(VI)初始濃度的增加,細胞受較高濃度 Cr(VI)毒性影響而降低了活性并減弱了還原能力,最終抑制了Cr(VI)的還原[9].

2.2 S. oneidensis MR-1接種量對Cr(VI)還原的影響

在其他條件不變的情況下,改變微生物接種量,研究S. oneidensis MR-1接種量對Cr(VI)還原的影響.從圖3中可以看出,隨著接種量的增加,Cr(VI)還原率也逐漸增大.當微生物接種量為 0.5×107、1×107、2×107CFU/mL時,Cr(VI)還原率在第 1d分別達到15%、25%和40%,在第7d分別達到80%、88%和100%;當接種量為2%時,20mg/L Cr(VI)還原率在第7d可以達到 100%.微生物在 Cr(VI)還原過程中具有十分重要的作用,增加接種量有利于Cr(VI)的生物還原.

圖3 接種量對S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的影響Fig.3 Effect of microbial inoculation density on Cr(VI)reduction by S. oneidensis MR-1

2.3 初始pH值對S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的影響

初始 pH 值分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,Cr(VI)濃度為20mg/L,在S. oneidensis MR-1作用下,Cr(VI)還原曲線如圖4所示.從圖4可以看出,S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的最適pH值為7.0,此時Cr(VI)還原率在第7d就達到了88%,pH值為5.0時Cr(VI)還原率最小,7d時只有 48%.而偏酸偏堿都會影響微生物對Cr(VI)的還原.pH為5.0時Cr(VI)還原率最小,pH 9.0時的Cr(VI)還原率高于pH 5.0.在弱堿性環境中多數菌體生長較好,而弱酸性環境中很多細菌也能生長,但細菌在弱堿性環境中的生長狀況好于弱酸性環境[17].在 Cr(VI)的微生物還原過程中,酶起到主導作用,合適的pH值環境有利于酶活性的提高.

圖4 初始pH值對S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的影響Fig.4 Effect of initial pH on Cr(VI) reduction by S. oneidensis MR-1

2.4 Fe(III)濃度對Cr(VI)還原的影響

微生物可以通過代謝產物間接還原 Cr(VI),例如Fe(III)還原菌可以將Fe(III)還原為Fe(II),再利用Fe(II)與 Cr(VI)反應,將 Cr(VI)轉化為低毒性和低遷移性的Cr(III),從而達到去除 Cr(VI)的目的[18].為考察 Fe(III)投加量對 Fe(III)-微生物體系還原 Cr(VI)的影響,分別設置投加 0,0.5,1,1.5mmol/L Fe(III)(以 Fe(OH)3形式)的處理組,進行S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)試驗,結果如圖5.

從圖中可以看出,投加了 Fe(III)的實驗組均取得了較好的Cr(VI)還原效果,Cr(VI)還原率在7d內均達到 100%.而隨著 Fe(Ⅲ)投加量的增加,Cr(VI)還原率雖仍有所增大,但增幅有限.由此可知,超過一定的濃度范圍,Fe(III)投加量對 Cr(VI)還原的影響不明顯.試驗中,沒有投加Fe(III)的處理,在第7d時Cr(VI)的還原率只達到了88%.

Fe(III)-微生物體系中 Cr(VI)的還原,微生物可通過直接還原和間接還原兩種方式作用于Cr(VI)[19].未投加 Fe(III)時,微生物通過酶促反應直接還原Cr(VI),還原速率較慢.投加 Fe(III)后,微生物可以較快地將 Fe(III)還原,同時生成的 Fe(II)可以與 Cr(VI)快速反應,將Cr(VI)還原為Cr(III),而Fe(II)自身被氧化為 Fe(III),可以重新參與氧化還原反應.這在一定程度上,也可以解釋 Fe(III)投加量增加時,Cr(VI)還原率增幅不大,是由于 Fe(Ⅲ)可以重復循環使用,即使投加較少量的 Fe(III)也足以較快地完成全部Cr(VI)的還原.

圖5 不同濃度Fe(OH)3對S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的影響Fig.5 Effects of different Fe(OH)3 concentration on Cr(VI)reduction by S. oneidensis MR-1

2.5 S. oneidensis MR-1吸附Cr(VI)的掃描電鏡及能譜分析

圖6 S. oneidensis MR-1吸附Cr(VI)的掃面電鏡能譜圖Fig.6 The SEM and EDS spectrum for S. oneidensis MR-1exposure to Cr(VI)

通過掃描電鏡(SEM)-能譜(EDS)實驗,對菌體表面形態和 Cr(VI)吸附進行觀察.王娟等[20]的實驗結果顯示,S. oneidensis MR-1在純培養48h后菌體呈圓形、橘黃色、無光澤、表面光滑、邊緣規則.而本實驗掃描電鏡能譜結果顯示,添加Cr (VI)處理后的實驗組,菌體形態有了一定的變化,并在菌體表面有 Cr的吸收峰出現.這說明菌體在對 Cr(VI)進行還原的過程中首先對Cr進行吸附作用.

2.6 S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的X射線光電子能譜分析

活體微生物可以直接還原Cr(VI),將Cr(VI)還原為Cr(III).為分析微生物體系Cr(VI)還原的產物,以及菌體表面及內部Cr的形態特征,本研究采用高性能X射線光電子能譜儀對S. oneidensis MR-1還原Cr的形態進行表征[21-22].

圖7為微生物體系Cr(VI)還原后,菌體中Cr形態的XPS全譜圖.圖中明顯出現C、N、O、Cr元素的俄歇譜線,以及Cr2p、C1s、O1S和N1s軌道的特征峰.隨著菌體暴露的Cr(VI)初始濃度增加,特征峰強也在增加.由圖8所示,Cr2p3/2軌道和Cr2p1/2軌道分別在結合能576～579eV和586～589eV處有明顯出峰.根據XPS標準能譜手冊可知,Cr2p3/2軌道處的出峰由Cr(VI)在(578.0±0.1)eV 處 的 出 峰 和 Cr(III)在(576.6±0.1)eV處的出峰疊加而成[23].根據Cr2p3/2軌道中峰面積計算分析,當初始濃度為 5mg/L時,Cr(III)/Cr(VI)在菌體表面的比率是1.4:1.此外,Cr2p3/2軌道的兩個峰值表示在微生物還原過程中有沉淀物 Cr2O3或 Cr(OH)3形成[24].Cr2p1/2軌道處的出峰由 Cr(VI)在(588.1±0.1)eV 處的出峰和 Cr(III)在(586.6±0.1)eV 處的出峰疊加而成,其結合能比 Cr2p3/2高 10.1eV.由此可知,菌體表面 Cr元素有 Cr(VI)和 Cr(III)兩種價態.由于各價態對應峰面積大小不一致,且 Cr(VI)在(588.1±0.1)eV 處的峰面積最小,而其他部分峰相當,所以菌體表面 Cr(III)的含量高于 Cr(VI)的含量.研究結果表明,菌體表面還原反應起到主要作用,并伴隨少量的吸附作用.這與湯潔等[16]的結論一致.

圖7 S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的XPS全譜Fig.7 XPS spectrum for S. oneidensis MR-1exposure to Cr(VI)

圖8 S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的Cr2p軌道峰Fig.8 XPS spectra of Cr2p for S. oneidensis MR-1exposure to Cr(VI)

3 結論

3.1 Cr(VI)濃度對S. oneidensis MR-1菌株生長有一定的影響,隨著Cr(VI)濃度的升高,菌株生長量明顯減少.高濃度Cr(VI)降低了S. oneidensis MR-1的Cr(VI)還原率,Cr(VI)可以通過制約菌株生長與活性來抑制Cr(VI)還原.

3.2 S. oneidensis MR-1對Cr(VI)的還原作用隨著接種菌懸液量的增加而增強;菌株最適生長pH值為中性,弱堿性環境比酸性環境更有利于菌株對 Cr(VI)的還原;增加Fe(III)的量會加快Cr(VI)被還原的速率.

3.3 掃描電鏡能譜分析顯示,Cr(VI)被吸附在 S.oneidensis MR-1菌體表面;而高性能X射線光電子能譜分析表明,在S. oneidensis MR-1菌體表面,Cr(VI)被還原成Cr(III).