不同程度重金屬污染對稻田土壤真菌群落結構的影響①

閆 華，歐陽明，張旭輝，應 多，趙熙君，張玉嬌，鄭聚鋒，劉曉雨，卞榮軍，李戀卿，潘根興

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不同程度重金屬污染對稻田土壤真菌群落結構的影響①

閆 華，歐陽明，張旭輝*，應 多，趙熙君，張玉嬌，鄭聚鋒，劉曉雨，卞榮軍，李戀卿，潘根興

(南京農業大學農業資源與生態環境研究所，南京 210095)

為了研究土壤真菌群落結構在不同程度重金屬污染中的變化，本文用Illumina HiSeq高通量測序技術分析了蘇南地區某金屬冶煉廠和加工產業區的重金屬污染水稻土的真菌群落結構，發現不同程度重金屬污染對水稻季土壤真菌豐度和群落結構均有顯著影響。經過真菌主成分分析發現，PC1影響因素對樣品處理差異的貢獻率是35.96%，PC2影響因素對樣品處理差異的貢獻率是21.48%；通過真菌冗余度分析發現，重金屬Pb和Cu污染對土壤真菌群落結構的影響顯著；通過對真菌屬水平的相對豐度分析表明，重金屬污染會顯著降低敏感真菌的豐度，如被孢霉屬相對豐度最高降低了87.50%、木霉屬最高降低了99.46%、離殼菌屬和菇屬最高降低了100.00%，同時耐性真菌的相對豐度會提高，如類球囊霉屬的相對豐度最高增加了98倍、四枝孢霉屬最高增加了56倍、根囊壺菌屬最高增加了2.62倍。綜上所述，不同程度重金屬污染對稻田土壤真菌群落結構有顯著影響，且隨著污染程度的增加，抗逆真菌相對數量和種類顯著增加，敏感真菌的相對數量急劇減少，真菌群落結構隨著重金屬污染程度增加進一步分化。

重金屬污染；稻田土壤；真菌群落結構；Illumina HiSeq高通量測序

重金屬在土壤中不易被微生物所分解，只能在環境中遷移、轉化，并不斷積累，當超過一定限度時便對植物和土壤微生物產生毒害作用，從而破壞土壤生態系統平衡，進而影響整個環境系統的功能[1-2]。土壤微生物是維持土壤生物活性的重要組分，在地球生物化學循環過程中扮演重要角色，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學反應，包括對動植物殘體的分解、養分的貯藏轉化、水分入滲、氣體交換、土壤結構的形成與穩定、有機物的合成及異源生物的降解等方面[3]，與土壤中的動植物相比土壤微生物群落結構組成對外界環境污染干擾更加靈敏。因此，土壤微生物群落結構是表征土壤生態系統群落結構和穩定性的重要參數，能夠較好地指示土壤環境污染狀況[4]。而真菌則對重金屬污染較細菌敏感，土壤重金屬污染可顯著減少真菌生物量、改變真菌群落組成[5-7]。

土壤真菌作為土壤微生物中重要的種類之一，參與有機質分解，促進物質循環，為植物提供養分，是生態系統健康的指示物種[8]。與細菌相比，真菌利用等量底物時，可以形成更多的自身生物量，且真菌能量流的周期較長[9-10]。真菌不僅能分泌胞外酶，而且其菌絲具有機械穿插作用，共同降解土壤中難降解的纖維素和木質素[11-12]，因此真菌可以更有效地利用有機底物，是土壤有機質分解和轉化的積極參與者。因此，雖然真菌數量不及細菌和放線菌，但真菌呼吸作用所釋放的CO2占土壤總呼吸作用的81% ~ 95%[13-14]，在陸地生態系統碳循環中占有重要地位。土壤重金屬污染可能會通過減少微生物對單一碳底物的利用能力，而減少群落的多樣性和改變其群落結構。如在重金屬污染的稻田土壤中，重金屬污染降低了微生物生物量和真菌優勢度，提高了代謝商，從而改變了稻田土壤中與碳素周轉相關的生物化學過程及CO2排放[15]。外界干擾如殺菌劑的使用、重金屬污染等，會影響真菌群落結構或改變豐富度，進而影響土壤有機質的降解[16-17]。不同程度的重金屬污染可能對土壤真菌的碳利用效率影響不同，如在培養條件下，土壤中較低濃度的重金屬污染可刺激土壤呼吸和土壤碳代謝作用，而較高濃度的重金屬污染則會抑制微生物的分解活動從而導致土壤有機碳礦化率降低[18]。研究表明長期Cd、Pb、Cu、Zn的復合污染降低了稻田土壤微生物生物量，污染程度越高，微生物生物量越低，且土壤微生物生物量與土壤有效Cd、Pb、Cu、Zn的含量呈顯著負相關關系[19]。重度重金屬污染可以顯著降低微生物多樣性指數，導致微生物群落結構發生實質性變化[20]，但在長期重金屬污染的田間環境中真菌群落結構是如何隨重金屬污染程度的變化而變化還需要進一步研究。

隨著現代生物技術的發展和分子生物技術水平的提高，在分子水平上研究重金屬污染對土壤微生物群落結構的影響已經成為可能。本研究利用Illumina HiSeq高通量測序技術分析了不同程度重金屬污染水平下稻田土壤真菌的群落結構差異，研究了不同程度重金屬污染對土壤中不同菌群的影響，探討了土壤中重金屬耐性菌和敏感菌的變化，以期為重金屬污染下水稻土有機碳穩定性機制的研究提供生物學方面的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤為水稻土-普通鐵聚水耕人為土，土壤樣品于2015年10月28日采自蘇南宜興地區某金屬冶煉廠和加工產業區的Pb-Cd污染水稻土，在污染源的下風向分別選取距污染源120 m(P1)、80 m(P2)、60 m(P3)、30 m(P4)及10 m(P5)的土樣代表不同污染程度的土壤樣品，并選取鄰近農作相同的未污染田塊作為對照(P0)。采樣時各處理隨機3點采集0 ~ 15 cm土壤樣品，田間混合后裝袋，將土樣盛于保鮮箱內帶回實驗室，分出部分鮮樣置于 –80 ℃冰箱中保存，供土壤總DNA提取；剩余土壤樣品剔除植物殘體和石塊后，風干，研磨后分別過20目和100目篩，過20目篩土壤用于測定土壤pH、CEC，過100目篩土壤用于測定土壤有機質、全氮、全磷、全鉀及土壤重金屬含量。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試土壤基本性質測定 供試土壤的基本理化性質參照《土壤農化分析》[21]相關方法測定。土壤Pb、Cd、Cu、Zn全量用王水-高氯酸消化[22]，土壤重金屬有效態含量采用DTPA浸提，其中Cu和Zn采用火焰原子吸收分光光度法測定，Cd、Pb采用石墨爐原子吸收分光光度法測定。

評價土壤重金屬污染水平高低，常用內梅羅污染指數[23]表示。內梅羅指數的計算公式如下：{[(均)2最大)2]/2}1/2，式中均和最大分別是平均單項污染指數和最大單項污染指數，內梅羅指數的計算參照國家土壤環境質量標準(GB15618-2008)。

表1為供試土壤樣品的基本理化性質，因為試驗地是一直作為農用地使用，各養分含量差異不顯著。表2是供試土壤樣品的重金屬全量和DTPA浸提有效態重金屬含量，根據國家土壤環境質量標準，綜合評價指標內梅羅指數的計算結果表明，無污染稻田內梅羅指數最低，污染區域越靠近污染源點的稻田，內梅羅指數越高，且主要污染因子為Pb、Cd。

表1 供試土壤樣品基本性質

表2 不同程度重金屬污染下土壤重金屬含量和內梅羅綜合指數

注：同列數據小寫字母不同表示不同土樣間差異顯著 (< 0.05)；土壤綜合污染程度分級：綜≤0.7 安全；0.7＜綜≤1.0 警戒線；1.0＜綜≤2.0 輕污染；2.0＜綜≤3.0 中污染；綜＞3.0 重污染。

1.2.2 土壤微生物基因組DNA的提取 取0.30 g土樣提取總DNA，使用DNA快速提取試劑盒(Power Soil，Mo Bio公司)，按操作說明進行。DNA提取完成后，用1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，并對土壤總DNA的濃度進行測定，測定采用NanoDrop ND-1000微量分光光度計。

1.2.3 土壤真菌豐度的測定——定量PCR技術 土壤真菌18S rRNA基因拷貝數采用熒光定量PCR的方法進行測定。定量試劑采用SYBR?TM(Takara Bio, Otsu, Shiga, Japan)反應液，實驗在iCycler IQ5定量PCR儀(Bio-Rad, Hercules, CA)上進行，定量反應體系為20 μl，包括1 μl的DNA模板，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μl，7.8 μl滅菌雙蒸水和10.4 μl擴增酶混合物。所用引物及PCR擴增程序見表3。

表3 定量PCR分析所用目的基因的引物序列及擴增程序

1.2.4 Illumina HiSeq高通量測序 隨著分子生物學技術的發展，土壤微生物學研究專家開發出一系列研究土壤微生物群落結構的方法，如PCR-DGGE、PLFA、BIOLOG，而這些方法往往會低估土壤微生物群落結構組成。隨著高通量測序技術的發展，因其能夠較為全面和準確地反映土壤微生物群落結構，并能較為客觀地反映其中低豐度的重要功能微生物等優勢，已逐漸成為土壤微生物學研究中最先進的測序手段。目前，應用于微生物測序的常見平臺有 454、Illumina 測序平臺，其中Illmina公司包含有HiSeq和MiSeq測序平臺，基于Solexa技術，其基本原理是單分子簇邊合成邊測序(Sequencing by Synthesis，SBS)和dNTP可逆終止化學反應，該測序方法的主要優點是通量高、準確率高以及成本低等[25-27]。本試驗研究采用Illumina HiSeq高通量測序技術，圖1為測序原理圖，表4 是測序所用引物序列。

圖1 測序原理圖

表4 高通量測序引物序列

1.3 數據分析方法

Illumina HiSeq高通量測序數據統計分析：對原始數據進行QC之后，用usearch軟件對數據進行去嵌合體和聚類的操作，usearch聚類時，先將reads按照豐度由大到小排序，通過97% 相似度的標準聚類，得到OUT，每個OUT被認為可代表一個物種。在聚類過程中利用denovo方法去除嵌合體。接下來對每個樣品的tags進行隨機抽平處理，并提取對應的OUT序列。然后使用Qiime軟件，做alpha多樣性指數的稀釋曲線，根據稀釋曲線選擇合理的抽平參數，利用Qiime軟件對得到的抽平后OUT進行分析，首先從OUT中分別提取一條reads作為代表序列，使用uclust方法，將該代表序列與ITS數據庫比對，從而對每個OUT進行物種分類。歸類后，根據每個OUT中序列的條數，從而得到OUT豐度表，最后根據該OUT豐度進行后續分析 (數據庫為：Findley ITS Database(ITS))。

數據處理用Excel 2003完成，采用SPSS 20.0統計軟件進行單因素方差分析(LSD法)，處理之間的顯著性分析均在<0.05 水平下進行。

2 結果與分析

2.1 高通量測序序列預處理結果

不同程度重金屬污染水平下真菌群落結構的變化通過Illumina HiSeq高通量測序進行分析，高通量測序獲得了883 206條原始序列，除去質量差的及嵌合體的序列，保留了863 969個序列，平均長度為240.14 bp。利用usearch在0.97相似度下進行聚類，對聚類后的序列進行嵌合體過濾后得到1 926個OUT，平均每個樣品有544 ± 26.95個OUT。由于不同樣本對應的reads數量差距較大，為了保證后期分析結果合理，對每個樣本的數據進行隨機抽平處理，抽平參數根據alpha多樣性指數的稀釋曲線確定為39 705條reads，抽平后總OUT數是1 926，平均OUT數是543.81。

2.2 不同程度重金屬污染土壤的真菌豐度及多樣性分析

由表5可知，與對照P0相比，重金屬污染土壤的真菌豐度均顯著減少，但不同濃度重金屬污染處理之間的差異不顯著。真菌的香濃指數和辛普森指數均沒有顯著差異，但是重金屬污染對真菌的豐富度有顯著影響，與對照相比，P5處理Chao1指數雖然增加，但是差異不顯著，中、低濃度重金屬污染差異顯著，豐富度指數顯著降低，且隨著污染程度的降低，豐富度指數降低。

表5 不同程度重金屬污染土壤真菌的豐度、多樣性指數及豐富度指數

注：同列數據小寫字母不同表示不同土樣間差異顯著(< 0.05)。

2.3 不同程度重金屬污染土壤的真菌群落結構主坐標分析

通過對不同程度重金屬污染下土壤真菌的主坐標分析發現(圖2)，各處理間真菌群落結構發生明顯的變化。PC1、PC2、PC3影響因素對樣品處理差異的貢獻率分別為35.96%、21.48%、11.71%，并將離污染源不同距離的采樣點明顯區分，大致呈現隨著距污染源距離由遠到近，PC1值呈現逐漸增大的趨勢。P5樣品作為高濃度重金屬污染樣品，與其余處理明顯分開，說明該樣品的真菌群落結構組成與其他樣品有顯著差異，P3、P4樣品作為中濃度重金屬污染樣品其真菌群落結構組成較相近，P1、P2樣品作為低濃度重金屬污染樣品其真菌群落結構組成較相近，且高中低3個程度重金屬污染樣品與對照P0相比，真菌群落結構組成差異顯著。

2.4 不同程度重金屬污染土壤的真菌類群分析

由圖3可知，在所有土壤樣品中檢測到7個真菌門，子囊菌門(Ascomycota)為最優勢門，其次是接合菌門(Zygomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)，相對豐度較少的是壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、Rozellomycota和新麗鞭毛菌門(Neocallimastigomycota)。其中Basidiomycota隨著重金屬污染程度增加其相對豐度減少，而Chytridiom-ycota隨著重金屬污染程度增加其相對豐度增加，但是這兩個門的真菌豐度在不同污染水平下差異均不顯著；Zygomycota的相對豐度隨著重金屬污染程度降低而顯著增加，與對照P0相比，P3、P4樣品其豐度差異不顯著，P1、P2樣品中顯著降低，在P5中最小；Ascomycota在重金屬污染樣品中的豐度與對照P0相比均顯著增加；與對照P0相比，Glomeromycota相對豐度隨著樣品受重金屬污染程度增加而增大，P4處理相對豐度最大；Rozellomycota的相對豐度在高污染樣品P5中最高，并與其他處理相比差異顯著；Neocallimastigomycota在P3樣品中豐度最高，與其他處理相比差異顯著。

進一步分析不同程度重金屬污染對不同真菌屬水平分布產生的影響，由表6可知，糞傘屬()、假酵母狀菌屬()及煙管霉屬()在各土樣間均不存在顯著差異。被孢霉屬()在P0樣品中豐度最大，與P3、P4土樣差異不顯著，與其他土樣相比差異顯著，且高濃度重金屬污染的P5樣品其豐度最小。擬拱頂菌屬()和單端孢霉屬()均在P1樣品中豐度最高，且與其他樣品差異顯著；田頭菇屬()在P2樣品中豐度最高，且與其他樣品差異顯著。這表明此3種真菌在較低濃度重金屬污染中可以正常生長，甚至低濃度重金屬會刺激其生長，增加其豐度；但高濃度重金屬污染，毒性增強，會抑制其生長，從而降低其相對豐度。離殼菌屬()和菇屬()均在P0樣品中其豐度最高，且與其他樣品處理差異顯著，這表明這兩種真菌屬對重金屬污染敏感，重金屬污染顯著影響其生長。穗葡萄孢菌屬()在高濃度重金屬污染樣品P5中豐度最高，且與其他樣品中的豐度有顯著差異，說明這種真菌在高濃度重金屬污染土壤中可以更好地生長，高濃度重金屬污染促進其生長。木霉屬()在高濃度重金屬污染樣品P5中豐度最低，顯著低于其他土壤樣品，說明高濃度重金屬污染抑制其生長。鐮刀菌()的相對豐度在P0與P1、P2、P3沒有顯著差異，在P4、P5樣品中顯著降低，表明鐮刀菌不耐高濃度重金屬污染，當重金屬污染程度較大時其豐度顯著降低。水玉霉屬()、四枝孢霉屬()、無足孢殼屬()及根囊壺菌屬()這4個真菌屬均在P0和P5樣品中其豐度出現顯著差異，P0與其他樣品均沒有顯著差異，說明這4種真菌能承受一定濃度的重金屬污染，當重金屬污染程度較大時，其生長遭到抑制，豐度顯著降低。類球囊霉屬()在P4樣品中其豐度最大，與其他處理的差異顯著，在P0樣品中豐度最小，表明這種真菌隨著重金屬污染程度的增加，其豐度增加，當達到最適重金屬濃度時達到最大豐度，重金屬污染程度再增加會降低其豐度。

圖2 不同程度重金屬污染土壤的真菌主坐標分析

圖3 不同程度重金屬污染土壤中主要真菌門的相對豐度

2.5 不同程度重金屬污染土壤的真菌群落結構組成與環境因子的冗余分析

為進一步了解土壤不同重金屬污染元素與真菌群落結構多樣性變化的對應關系，引入了RDA分析。由圖4可知，重金屬污染對真菌群落結構的影響顯著，影響程度最大的環境因子是全量Pb和全量Cu，其次是有效態Cu和Pb。其中全量Pb與Cd、Zn呈負相關關系，與Cu是正相關關系；有效態Zn與Cd呈負相關關系，與Cu、Pb呈正相關關系。總量Pb對樣品的影響程度最大，對真菌群落結構的影響差異顯著。

表6 不同程度重金屬污染下土壤優勢真菌屬的相對豐度(%)

注：數據是平均值，同一行數據小寫字母不同表示同一真菌屬相對豐度在不同土樣間差異達到<0.05顯著水平。

圖4 不同程度重金屬污染土壤真菌冗余分析(RDA)

3 討論

不同重金屬元素對土壤真菌群落結構影響不同。本研究通過RDA分析發現，重金屬Pb和Cu污染對真菌群落結構的影響最顯著，Cd次之，Zn的影響最小，且Cd、Pb、Cu和Zn 4種金屬元素對真菌群落結構的復合效應機制表現為協同效應和拮抗效應并存，這與韓桂琪等[28]研究結果相似。在對重金屬污染下紅壤微生物群落結構變化的研究中發現，Cd、Cu對供試土壤微生物學指標的毒性影響較為明顯，Zn次之，Pb的影響最小[29]；楊曄等[30]認為Cd對真菌的抑制比較明顯。造成這種不同重金屬元素影響能力不同的原因可能是供試土樣的重金屬元素濃度、土壤類型和基本性質等不同，從而使不同重金屬元素的生物毒性出現差異。

野外長期的重金屬污染會顯著降低真菌豐度，改變土壤中微生物耐性菌的比例。通過分析不同程度重金屬污染下稻田土壤真菌屬水平下的相對豐度變化情況可知，類球囊霉屬、青霉屬等真菌其相對豐度均在重金屬污染嚴重的土壤樣品中存在顯著增加趨勢，其中類球囊霉屬隨著重金屬污染程度增加，其相對豐度顯著增高，說明這類真菌對重金屬有一定的耐性。這與孔凡美[31]的研究結果相似，其在沈陽礦區重金屬污染土壤中發現類球囊霉屬的相對豐度顯著增高，而類球囊霉屬中有些菌種屬于叢枝菌根真菌，對重金屬污染具有較強的耐性和適應能力，這些叢枝菌根真菌能夠改善植物生長狀況，減輕重金屬對植物的毒害。杜立棟等[32]研究發現某株青霉菌真菌可富集土壤中的可溶態鉛離子，最高富集率達96.54%，而青霉能夠產生草酸與重金屬發生化學反應，生成不溶性的草酸鹽，減少Pb的毒性。在高濃度銅離子培養基中，真菌抗銅菌株青霉可以誘導細胞合成高濃度的甘油幫助其排出過量的銅離子[33]。這些研究結果均表明，重金屬污染會增加耐性菌的數量，改變土壤中的優勢菌群結構，進一步改變微生物群落結構。

重金屬污染還會顯著影響土壤中敏感菌的比例。本研究中被孢霉屬、離殼菌屬與菇屬對重金屬比較敏感，在重金屬污染水稻土中其相對豐度均明顯降低，且被孢霉屬相對豐度隨著重金屬污染程度增加而顯著降低。被孢霉屬可生產多不飽和脂肪酸，是被認為最有前途的工業生產多不飽和脂肪酸的微生物，而且被孢霉屬有的菌種可以兼性寄生于線蟲卵囊、卵和雌蟲，殺死線蟲[34-35]。木霉屬和鐮刀菌的相對豐度只在重金屬污染嚴重的土壤樣品中顯著降低，可能原因是這兩種真菌具有一定的重金屬抗性，但是當重金屬濃度過高時，其生長受到顯著抑制，相對豐度顯著降低。木霉屬的某些菌種如綠色木霉菌對重金屬污染有一定的耐受能力，能耐受Pb2+濃度為2 000 mg/L[36]，已有研究也發現了一種耐受重金屬的非致病內生尖孢鐮刀菌可以促進超積累植物提取和積累重金屬的功能[37]，而從鉛鋅尾礦廢棄地分離出耐重金屬Cd的尖孢鐮刀菌的耐Cd濃度是15 mmol/L[38]。

這些研究均表明，長期重金屬污染脅迫會改變真菌群落結構組成，使某些在沒有污染脅迫的土壤中不占優勢，但具有某些特殊功能而在重金屬污染環境中正常生活的微生物成為優勢種群。造成這種現象的可能原因是，重金屬污染脅迫改變原有的群落結構內部種群競爭關系，導致原來的優勢種群失去優勢地位，耐性菌群快速生長，成為重金屬污染環境中的優勢種群[39]；或者是一部分微生物在長期重金屬污染環境中產生的重金屬抗性，保護了其他種群的微生物，從而使重金屬污染土壤的優勢種群發生了明顯改變[40]。

4 結論

綜上所述，重金屬污染會顯著改變土壤真菌的豐度和群落結構，其中重金屬Pb和Cu對真菌群落結構的影響最大，且隨著污染程度增加，真菌群落結構組成發生了顯著變化，抗逆真菌相對數量和種類顯著增加，敏感真菌的相對數量急劇減少，如對重金屬較敏感的被孢霉屬等的相對豐度顯著降低，而耐性菌如類球囊霉屬的相對豐度顯著增加，敏感菌降低，耐性菌增加，且隨著污染程度的增加，微生物群落結構進一步分化，這使得微生物群落對環境脅迫的適應能力進一步增強。

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Effects of Different Gradients of Heavy Metal Contamination on Soil Fungi Community Structure in Paddy Soils

YAN Hua, OUYANG Ming, ZHANG Xuhui*, YING Duo, ZHAO Xijun, ZHANG Yujiao, ZHENG Jufeng, LIU Xiaoyu, BIAN Rongjun, LI Lianqing, PAN Genxing

(Institute of Resource, Ecosystem and Environment of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Fungi community structure in paddy soils in south Jiangsu under different gradients of heavy metal pollution was analyzed in order to study the impact of heavy metal pollution on the microbial variability. The results showed that heavy metal pollution has significant impact on fungi number and community structure in paddy soil. Principal coordinate analysis (PCoA) revealed that the first and second components accounted for 35.96% and 21.48% of contribution rates, respectively. The results of redundancy analysis (RDA) showed that Pb and Cu greatly influenced fungi community structure. Relative abundance analysis of fungi at genus taxonomic level showed that heavy metal pollution significantly reduced the population of sensitive fungi but increased the population of patience fungi. Sensitive fungi genus included Mortierella, Trichoderma, Apodus and Hypholoma, wheras patience fungi genus included Paraglomus, Tetracladium and Rhizophydium. In conclusion, heavy metal-contamination can significantly influences soil fungi community structure in paddy soils, increasing heavy metal concentration can increase the population and diversity of heavy metal tolerant fungi and decrease sensitive fungi, which furtherly increases the differentiation of the structure of fungi community.

Heavy metal pollution; Paddy soil; Fungi community structure; Illumina HiSeq sequencing

國家自然科學基金項目(41471193)和江蘇高校品牌專業建設工程項目(PPZY2015A061)資助。

(xuhuizhang@njau.edu.cn)

閆華(1990—)，女，山東棗莊人，碩士研究生，主要研究方向為土壤環境學。E-mail: 2014103102@njau.edu.cn

10.13758/j.cnki.tr.2018.03.011

X53；S154

A