eEF2K對MDA-MB-231細胞增殖的影響與初步機制研究

肖 敏，王根柱，戚 欣，李 靜

(中國海洋大學醫藥學院分子藥理室，山東 青島 266000)

真核延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor 2 kinase，eEF2K)又稱鈣調蛋白依賴性激酶Ⅲ(CaM kinase Ⅲ)，是1985年由Nairn等[1]從哺乳動物中首次發現的，屬于“α-激酶”家族。eEF2K共由724個氨基酸組成，分子質量約81 499 u。已有研究發現，當細胞面臨一定的應激壓力時，eEF2K能夠磷酸化其細胞內唯一底物蛋白eEF2，抑制蛋白質合成過程中肽鏈延伸階段，降低細胞中氨基酸和能量的消耗，使細胞能夠在代謝壓力下得以存活[2-3]。近年研究發現，eEF2K在一些腫瘤細胞中的表達和活性會影響腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等生理進程[3-6]，但在不同的腫瘤細胞中，eEF2K表現出不同作用。已有文獻報道[3, 5-7]，在人成骨肉瘤細胞、膠質瘤細胞、乳腺癌細胞中，抑制eEF2K能夠提高腫瘤細胞對貧營養狀態的敏感性，導致細胞死亡；而在結腸癌、宮頸癌以及肝癌細胞中，貧營養狀態下抑制eEF2K則能夠增強細胞對貧營養條件的耐受，從而存活下來。

MDA-MB-231細胞為三陰性乳腺癌細胞，具有強侵襲性和高轉移性，臨床預后不良。由于缺乏治療靶點，臨床對于三陰性乳腺癌的治療仍是一大難題。為了進一步揭示eEF2K在三陰性乳腺癌細胞中的作用，本文觀察了eEF2K在不同培養條件下，對腫瘤細胞MDA-MB-231生長的影響，并初步探討作用機制，為闡明eEF2K在三陰性乳腺癌中的作用以及開發新的治療靶點奠定基礎。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器L-15培養基(杭州吉諾)；eEF2K shRNA(h) Lentiviral Particles和Control shRNA Lentiviral Particles (Santa Cruz)；eEF2、eEF2K、Akt、ERK、Src、mTOR、JAK、PI3K及其磷酸化抗體(Cell Signaling Technology)；β-actin 抗體、羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗(杭州華安)；ECL化學發光液(Thermo Fisher)；吉姆薩染液(北京雷根生物)。Epoch2 酶標儀、Protein Simple成像系統(Bio-tek公司)；Life拍照顯微鏡(Life Technology公司)。

1.2穩定轉染細胞株的構建MDA-MB-231細胞購自中科院上海細胞庫。MDA-MB-231細胞于L-15(含15%胎牛血清和1%青鏈霉素)培養基中，置于37℃、無二氧化碳條件下培養。待細胞密度達到80%以上時，胰酶消化并接種于24孔板中。 48 h后，各孔分別加入不同濃度的嘌呤霉素(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5 mg·L-1)，篩選出能夠殺死所有細胞的嘌呤霉素的最低濃度。同樣條件接種細胞于24孔板，分別加入eEF2K shRNA (h) Lentiviral Particles和Control shRNA Lentiviral Particles，感染細胞24 h，加入嘌呤霉素篩選，獲得穩定抑制eEF2K表達的MDA-MB-231細胞穩轉株和空載體穩轉株，分別記作MDA-MB-231 sheEF2K和MDA-MB-231 shNC細胞。

1.3SRB法測定細胞增殖曲線MDA-MB-231、MDA-MB-231 shNC和MDA-MB-231 sheEF2K 3種細胞于L-15(含15%血清和1%青鏈霉素)培養基中，置于37℃、無二氧化碳條件下培養。待細胞密度達到80%以上時，胰酶消化，并以3 000個/孔接種于96孔板中。貼壁后，更換完全培養基。以MDA-MB-231細胞倍增時間大約為23 h為參考，設置時間梯度，分別培養0、12、24、48、72、96 h后，采用SRB法，于515 nm處測定各孔吸光度值，并繪制細胞增殖曲線。同樣方法測定3種細胞在無糖和無血清培養條件下的增殖曲線。

1.4平板克隆檢測細胞克隆形成能力將MDA-MB-231、MDA-MB-231 shNC和 MDA-MB-231 sheEF2K 3種細胞于L-15 (含15%血清和1%青鏈霉素)培養基中，置于 37℃、無二氧化碳條件下培養。待細胞密度達到80%以上時，胰酶消化，并以500個/孔接種于6孔板中。37℃、無二氧化碳條件下培養15 d。棄去培養液，甲醇固定細胞3 min，晾干。吉姆薩染液染色15 min，流水洗去浮色，晾干，拍照。顯微鏡下計數超過50個細胞的克隆數。

1.5Westernblot檢測相關信號分子表達將MDA-MB-231、MDA-MB-231 shNC和 MDA-MB-231 sheEF2K 3種細胞于L-15(含15%血清和1%青鏈霉素)培養基中，置于37℃、無二氧化碳條件下培養。待細胞密度達到80%以上時，胰酶消化并以2×105個/孔接種于6孔板中。待細胞密度生長至80% 左右時，棄去培養基，RIPA裂解液裂解40 min后收樣，加上樣buffer煮沸15 min，保存于-20℃。配制8%的SDS-PAGE凝膠，上樣電泳分離后，轉印至NC膜上。5%的脫脂牛奶封閉2 h，4℃孵育一抗過夜。TBST洗4次，室溫孵育二抗1 h，ECL發光檢測3種細胞中相關信號分子(Akt、ERK、Src、mTOR等)的表達和活化情況。每組實驗重復3次。

2 結果

2.1eEF2K抑制的穩定細胞株構建慢病毒顆粒感染細胞24 h后，加入嘌呤霉素篩選。取出部分細胞，Western blot檢測eEF2K的抑制效率。結果表明，與對照組細胞MDA-MB-231 shNC相比，MDA-MB-231 sheEF2K細胞中eEF2K的表達明顯下降，抑制效率可達71.76%(Fig 1A、1C)。并且eEF2K抑制后，細胞中eEF2K活性也降低，eEF2磷酸化明顯減少(Fig 1B、1D)。此外，與野生細胞MDA-MB-231相比，MDA-MB-231 shNC細胞中eEF2K的表達無明顯變化，表明空載體自身沒有影響eEF2K的表達。上述結果表明成功構建了eEF2K低表達的穩轉細胞株，可以用于后續實驗。

Fig 1 Different MDA-MB-231 cells constructed with

2.2抑制eEF2K后對不同培養條件下MDA-MB-231細胞增殖的影響將MDA-MB-231細胞及構建的兩種穩定轉染細胞株接種于96孔板，SRB法分別測定3種細胞在完全、無糖和無血清培養條件下的增殖曲線。結果發現，與完全培養條件下MDA-MB-231細胞相比，在無糖和無血清的培養條件下，MDA-MB-231細胞增殖速度明顯降低。但在無糖和無血清的培養條件下，相對于MDA-MB-231 shNC細胞，eEF2K明顯抑制的MDA-MB-231 sheEF2K細胞仍表現出較快增殖，在72 h增殖率為分別31.08%和25.63%(Fig 2A、2B)。Western blot檢測MDA-MB-231細胞中 eEF2K的活性，發現在上述貧營養狀態下，MDA-MB-231細胞中eEF2磷酸化水平明顯升高，表明該條件下eEF2K被激活(Fig 2C、2D)。上述結果表明，貧營養條件下，eEF2K抑制能夠促進乳腺癌細胞生長。

在完全培養條件下，與MDA-MB-231 shNC細胞相比，eEF2K明顯抑制的MDA-MB-231 sheEF2K細胞增殖卻被抑制(Fig 3A)，并具有時間依賴性，96 h最高抑制率達33.02%。同樣，平板克隆實驗結果發現，抑制eEF2K表達的 MDA-MB-231 sheEF2K細胞株形成的克隆數明顯少于其對照細胞，抑制率為22.48%(Fig 3B)。上述結果表明，在完全培養基培養條件下，eEF2K抑制降低了乳腺癌細胞的增殖能力。

2.3抑制eEF2K后對腫瘤細胞相關增殖信號通路活化的影響Western blot法檢測MDA-MB-231細胞及構建的MDA-MB-231 shNC細胞、MDA-MB-231 sheEF2K細胞在完全培養條件下，增殖相關蛋白的表達與活化。灰度分析結果發現，MDA-MB-231 sheEF2K細胞中Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平明顯降低，其上游分子PI3K活性幾乎不受影響(Fig 4A、4C)。而其他增殖相關蛋白如 Src、ERK、JAK磷酸化水平相比于自身蛋白表達均未見明顯減少(Fig 4B、4D)。表明在MDA-MB-231細胞中，完全培養條件下，eEF2K減少引起的細胞增殖抑制可能與 Akt-mTOR信號通路活化降低有關。

3 討論

據文獻報道，貧營養狀態下，eEF2K激活，導致其下游底物eEF2磷酸化，降低eEF2與核糖體結合的能力，抑制翻譯延伸，減少氨基酸和能量的消耗，維持細胞生存[2-4, 8-9]。本實驗發現，與完全培養條件相比，貧營養狀態下的MDA-MB-231細胞增殖速度明顯降低。Western blot結果也表明，貧營養條件下，eEF2K被激活，表明蛋白合成被抑制，細胞增殖速度維持在較低水平。該現象與文獻報道一致。相同的道理，在貧營養情況下，eEF2K抑制的MDA-MB-231 sheEF2K細胞增殖速度明顯高于對照組細胞MDA-MB-231 shNC，且在72 h時最為明顯。表明eEF2K被抑制后，其蛋白合成抑制作用消失，細胞仍能繼續增殖，即抑制eEF2K能夠降低腫瘤細胞對貧營養狀態的敏感性，該現象也與文獻報道一致[5]。而在完全培養條件下，利用SRB方法觀察細胞增殖情況時，我們發現，與對照組MDA-MB-231 shNC相比，MDA-MB-231 sheEF2K增殖速度明顯被抑制。進一步應用平板克隆實驗也發現，抑制eEF2K的表達也明顯抑制了MDA-MB-231 shNC細胞的克隆形成。上述實驗均沒有觀察到野生的MDA-MB-231細胞與MDA-MB-231 shNC細胞具有明顯差別。這些研究表明，抑制eEF2K的表達，對不同細胞培養條件下細胞的生長具有不同的影響。

Fig 2 Effect of eEF2K inhibition on cell growth of different MDA-MB-231 cells in different media

Fig 3 Effect of eEF2K inhibition on cell growthof different MDA-MB-231 cells

為此，我們進一步對完全培養條件下的3種細胞中增殖相關信號通路進行了檢測。細胞中增殖相關信號通路主要有3條：RPTK-Ras-MAPK信號通路、JAK-STAT信號通路和PI3K-Akt-mTOR信號通路[10-13]。我們采用Western blot方法檢測了上述信號通路中的相關分子，結果發現，與MDA-MB-231細胞和MDA-MB-231 shNC細胞相比，MDA-MB-231 sheEF2K細胞中Akt和mTOR的磷酸化水平明顯降低，而上游分子PI3K活化無明顯變化，其他分子如 Src、ERK、JAK磷酸化水平也均未明顯變化，提示eEF2K抑制后，對MDA-MB-231的增殖抑制作用可能與Akt-mTOR信號通路活性下降有關，且與上游分子PI3K無關。

Fig 4 Effect of eEF2K inhibition on protein expression andactivation of different MDA-MB-231

eEF2K作為翻譯延伸因子激酶可以磷酸化eEF2，抑制蛋白的翻譯延伸。本研究發現，不同培養條件下，eEF2K對細胞生長影響明顯不同。特別是發現完全培養條件下，eEF2K抑制后抑制了MDA-MB-231的增殖，并且與Akt-mTOR信號通路活化下降有關，提示eEF2K除了具有翻譯延伸因子激酶的作用以外，可能還存在著其它的功能，可能是三陰性乳腺癌細胞治療的新靶點，值得今后進一步研究。

(致謝：本實驗是在中國海洋大學醫藥學院分子藥理室完成的，感謝澳大利亞南澳洲健康醫療研究所Christopher G Proud 教授和王學敏老師提供的質粒。)