環氧化酶-2與骨形態發生蛋白9誘導血管平滑肌鈣化的關系研究

廖云鵬，何 芳，江 芬,4，王 涵，朱茄慧，馬 妍，胡 瑩，李福書，李 沁，周 婭，何百成

(1. 重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室；2. 重慶醫科大學藥理學教研室；3.重慶醫科大學附屬第一醫院腎內科,重慶 400016;4. 湖北省蘄春縣人口和計劃生育服務中心,湖北 蘄春 436300)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是引起心血管相關疾病發病率和病死率升高的重要原因之一。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)鈣化是CKD的并發癥之一，該過程可能是由高鈣和(或)高磷引起[1-2]。文獻報道，高磷誘導血管鈣化的作用與促進細胞凋亡和成軟骨分化有關[3]。參與該病理過程的信號包括BMPs/Smads、Wnt/β-catenin信號等[4]。血管鈣化和骨形成有很多相似之處，BMPs屬于TGF-β超家族成員，對骨發生、發育和骨折愈合具有重要調節作用，目前發現20余種BMPs。其中，BMP2和BMP7具有成骨分化誘導能力，已被FDA批準用于脊柱融合以及骨移植的融合治療[5]。 BMP9與BMP2具有相似的成骨誘導作用，且誘導成骨分化能力明顯強于BMP2[6]。文獻報道，BMP9可通過ALK1依賴的方式誘導VSMCs鈣化[7]。但是，在血管鈣化過程中，BMP9與磷酸鹽的關系以及BMP9誘導血管鈣化的詳細機制并不明確。環氧酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)作為一種促炎因子，是前列腺素合成的限速酶。此外，COX-2也參與骨折愈合以及干細胞骨分化的調節。研究顯示，敲除COX-2能引起骨折愈合延遲，COX-2抑制劑能夠減輕臨床外科手術術后的異位骨化[8]。BMP9在誘導間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)骨向分化時，能促進COX-2表達[8]。因此，COX-2可能對VSMCs鈣化有促進作用。但也有相關研究顯示，抑制COX-2能促進VSMCs鈣化，即COX-2可能具有降低血管鈣化的作用[9]。這種現象可能與所用細胞和誘導因子的不同，以及微環境有關。但是，COX-2在VSMCs鈣化中的作用需要進一步明確。本研究主要探索BMP9與高磷誘導VSMCs鈣化的關系， COX-2與BMP9誘導VSMCs鈣化的關系，以及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 ♂ SD大鼠購自重慶醫科大學動物實驗中心，合格證號：SCXK (渝) 2017-0001。所有的動物實驗均符合重慶醫科大學醫學科學院實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會規定。

1.1.2試劑 所用一抗均購自圣克魯斯生物技術公司(Santa Cruz)；COX-2抑制劑(NS-398)購自Sigma-Aldrich公司。

1.1.3儀器 細胞培養箱(美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；定量PCR儀及凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；電泳儀、垂直電泳槽、濕式轉膜儀(北京六一儀器廠)。

1.2原代大鼠VSMCs的分離與培養用頸椎脫臼法處死大鼠，取主動脈血管，小心地去除內層和外層血管平滑肌，收集中層平滑肌并切分成小部分，在DMEM培養基中培養。將VSMCs培養在含有10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素以及100 μg·L-1鏈霉素的高糖DMEM中。培養條件為37℃、5% CO2。α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是VSMCs的特異性標志物，提取的原代細胞經α-SMA免疫熒光檢測，超過90%的細胞為VSMCs。本實驗所用的細胞為第3～8代。

1.3重組腺病毒BMP9、COX-2、綠色熒光蛋白載體(GFP)構建重組腺病毒采用AdEasy系統構建。用PCR將BMP9、COX-2以及GFP編碼序列擴增，然后克隆到穿梭載體上。然后將穿梭質粒與AdEasy-1質粒在BJ5183細菌中進行重組。最后將重組好的質粒線性化，并轉染到HEK293細胞進行重組腺病毒包裝。重組GFP腺病毒作為載體對照。研究BMP9對VSMCs及離體器官培養影響時，用低、中、高BMP9腺病毒(AdBMP9)滴度處理。

1.4總RNA提取、cDNA制備及PCR實驗總RNA用TRIzol提取，采用逆轉錄反應將RNA逆轉錄成cDNA。所得產物稀釋5～10倍作為real-time PCR的模板。所有的結果都使用GAPDH作為內參。每組實驗重復3次。本實驗所用引物序列見Tab 1。

Tab 1 The primer sequences used for this investigation

1.5蛋白免疫印跡實驗將細胞種于6孔板中，按實驗設計加入相應處理因素。在相應的時間點裂解細胞，并煮沸10 min。將樣品在SDS-PAGE中分離后，轉移到聚偏氟乙烯膜上，用10%的脫脂奶粉封閉。用相應的一抗和二抗分別進行孵育，最后用超敏ECL化學發光法測定靶蛋白表達情況。每組實驗重復3次。

1.6茜素紅染色實驗將細胞種于24孔板，按實驗設計加入相應處理因素，14 d后進行檢測。染色過程簡述如下：將細胞用0.05%的戊二醛在室溫固定10 min，然后用PBS洗2次。最后用0.4%茜素紅染料孵育5 min，小心洗去染料。茜素紅的定量分析采用10%乙酸溶解，吸光度測定波長為405 nm。 每組實驗重復3次。

1.7主動脈環器官離體培養胸主動脈取自♂ SD大鼠，將血管切割成2～3 mm厚度的動脈環，在DMEM培養基中培養24 h后達到穩定狀態。用AdGFP、AdBMP9、NS-398和(或)AdBMP9處理主動脈環7、14 d。標本用10%褔爾馬林固定后，用石蠟包埋、切片，進行組織化學染色。每組實驗重復3次。

1.8VonKossa染色石蠟包埋的主動脈切片在紫外光下2%硝酸銀處理60 min，用雙蒸水清洗5 min；然后用5%硫代硫酸鈉處理2 min，再用雙蒸水清洗5 min，蘇木精伊紅復染1～2 min。乙醇脫水后，用二甲苯透明處理，最后進行封片，并在顯微鏡下拍照。每組實驗重復3次。

2 結果

2.1磷與VSMCs鈣化的關系Fig 1免疫熒光檢測結果顯示，超過90%的細胞α-SMA表達陽性。蛋白印跡的結果顯示，磷酸鹽一方面下調α-SMA表達，另一方面則增加Runx2、骨橋蛋白(osteopontin, OPN)、骨鈣素(osteocalin, OCN)的表達。茜素紅染色結果顯示，磷酸鹽明顯誘導VSMCs礦化。以上結果進一步證實，高濃度磷酸鹽可誘導VSMCs鈣化。

2.2高磷對VSMCs中BMP9表達的影響Fig 2的Western blot結果顯示，高磷能上調BMP9在VSMCs中的表達。Real-time PCR結果顯示，高表達BMP9能上調Runx2、Dlx-5、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的mRNA水平，但降低SM22α的水平。以上結果提示，BMP9可能參與磷酸鹽誘導VSMCs鈣化的過程。

Fig 1 Effects of phosphate on inducing calcification in VSMCs

Fig 2 Effects of BMP9 on expression of early osetogenic markers in VSMCs

2.3BMP9對VSMCs與胸主動脈鈣化的影響Fig 3的Western blot分析結果顯示，過表達BMP9能上調OPN和OCN的水平，但降低α-SMA的蛋白水平。同時，BMP9也能直接在VSMCs中明顯誘導礦化。ALK2突變能明顯降低BMP9在VSMCs中誘導鈣鹽沉積的能力。主動脈環硝酸銀染色結果顯示，過表達BMP9也能明顯促進血管平滑肌鈣化。以上結果提示，BMP9能誘導血管鈣化，但具體機制還不清楚。

Fig 3 Effects of BMP9 on calcification in VSMCs and thoracic aorta

2.4磷酸鹽對VSMCs中COX-2表達的影響Fig 4的Western blot分析結果顯示，磷酸鹽呈濃度依賴性上調COX-2水平。同時，BMP9也能明顯增加COX-2在VSMCs中的水平。以上結果提示，COX-2可能也參與血管鈣化的過程。

2.5COX-2對BMP9誘導VSMCs與胸主動脈鈣化的影響Fig 5的Western blot分析結果顯示，過表達COX-2能增強BMP9下調α-SMA和促進OPN與OCN表達的作用；COX-2抑制劑(NS-398)能減弱BMP9下調α-SMA和促進OPN與OCN表達的作用。茜素紅染色結果顯示，BMP9能明顯誘導VSMCs鈣化，但NS-398可明顯減弱BMP9的這種作用。以上結果表明， COX-2可能參與介導BMP9誘導VSMCs鈣化的作用。

Fig 4 Effects of phosphate on expression of COX-2 in VSMCs

Fig 5 Effects of COX-2 on BMP9-induced calcification in VSMCs and thoracic aorta

3 討論

血管鈣化是CKD的主要并發癥之一，但VSMCs鈣化的具體分子機制迄今仍不明確。本研究證實，磷酸鹽能誘導VSMCs鈣化并促進BMP9的表達； 同時，BMP9能直接誘導VSMCs鈣化，磷酸鹽及BMP9均能誘導COX-2表達，且COX-2可能參與介導BMP9誘導VSMCs鈣化的作用。

來自血管壁的VSMCs可以分化為成骨樣細胞[10]，這一過程可能與BMPs/Smads和Wnt/β-catenin信號活性增加有關[11],也提示高磷誘導VSMCs血管鈣化可能也與上述因素有關。BMPs作為促進骨發育和骨折修復的因子，能誘導干細胞骨向分化，其中BMP2和BMP7已經被證實參與血管鈣化的過程[12]。BMP2能增加血液中磷酸鹽水平，并參與RANKL促進VSMCs鈣化的過程。出生以后，BMP7主要在腎臟中表達，并參與調控骨重建和VSMCs的表型；同時，BMP7的多態性對血管鈣化也存在不同的影響[13]。BMP9是目前研究相對較少的BMP成員，但其誘導MSCs骨向分化的能力明顯強于其他BMPs。據報道，BMP9可通過經典BMPs/Smads和非經典BMPs/Smads信號發揮作用，其受體可能主要是ALK1和ALK2[14]。BMP9除能誘導MSCs骨向分化外，還可經ALK1依賴的方式誘導VSMCs鈣化。但是，高磷酸鹽誘導VSMCs鈣化是否與BMP9有關，目前尚不清楚。本研究結果顯示，磷酸鹽以濃度依賴性方式增加BMP9在VSMCs中表達。過表達BMP9能誘導VSMCs鈣化，并降低α-SMA的水平；ALK2突變明顯降低BMP9在VSMCs中誘導鈣鹽沉積的能力。結果表明，高磷酸鹽誘導VSMCs鈣化與促進BMP9表達有關，BMP9本身可以通過依賴ALK1和ALK2的方式誘導VSMCs鈣化。但是，BMP9誘導VSMCs鈣化的具體機制仍不清楚。

炎癥與多種疾病有關，包括血管平滑肌鈣化。一些炎癥因子也參與VSMCs鈣化的過程，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。高磷水平可以誘導血管平滑肌鈣化，同時也可以激活炎癥系統。COX-2是主要的炎癥誘導因子之一，其抑制劑在臨床上作為抗炎鎮痛和解熱藥物使用。但是，磷酸鹽誘導血管鈣化與COX-2的關系目前還尚不明確。我們前期的研究顯示，在MSCs骨向分化的過程中，BMP9能明顯上調COX-2表達；沉默或抑制COX-2能明顯減弱BMP9誘導MSCs骨向分化的作用[8]。因此，我們推測在VSMCs中，高磷促進BMP9表達的同時，也會上調COX-2，且COX-2可能也參與BMP9誘導的VSMCs鈣化。研究結果顯示，高磷能增加COX-2的表達；在VSMCs細胞中，過表達COX-2能促進BMP9誘導的成骨指標表達；相反，COX-2抑制劑則明顯減弱BMP9的這種作用。但是，也有研究表明COX-2有逆轉血管鈣化的功能[15]。COX-2對鈣化的不同影響可能與誘導因子的不同、抑制劑的濃度以及微環境不同有關。

本研究顯示，高磷酸鹽誘導VSMCs鈣化與促進BMP9表達有關；同時，BMP9能誘導VSMCs鈣化，該作用可能與上調COX-2表達有關。結果提示，非甾體類藥物可能在臨床對血管鈣化具有一定的預防作用。

[致謝：本研究的主要工作完成于重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，課題組感謝芝加哥大學醫學中心何通川教授(T.C. He)為本研究提供重組腺病毒。]