下丘腦室旁核膠質細胞活化在大鼠炎性痛調節過程中的作用

陳彬彬，孟 娜，黃思婷，花景煜，孫國林，陳盼盼，章功良，張詠梅

(1. 江蘇省麻醉學重點實驗室，徐州醫科大學麻醉學院，江蘇 徐州 221002；2. 安徽醫科大學基礎醫學院，安徽 合肥 230032)

研究表明，中樞神經系統膠質細胞活化參與外周炎癥性疼痛反應[1]，而長期以來，膠質細胞被認為是神經元的間質細胞或支持細胞。近年來發現，膠質細胞的激活對炎癥性疼痛的發生和發展發揮了重要作用，它們的激活可以分泌多種致痛物質，增強外周有害刺激激活的神經元疼痛信號傳導[2]。小膠質細胞是中樞免疫反應效應細胞，其分支狀突起可即時感知周圍環境的變化，對腦組織內的微小病理變化即發生強烈反應，在自閉癥[3]、阿爾茨海默病[4]、Rett綜合征[5]等神經發育障礙性疾病中發揮重要作用，其激活時不僅可以釋放出經典的神經、膠質活性物質，還可以釋放出促炎或抗炎細胞因子，并且在疼痛信號傳遞過程中發揮重要作用[6]。星形膠質細胞與神經元以及突觸緊密接觸，這不僅可以支持和營養神經元，而且在調節突觸傳遞過程、神經元胞外化學環境穩定方面發揮重要作用[7]。傳統研究認為，慢性疼痛的產生是由于神經元可塑性改變引起的外周和中樞敏化作用，本課題組前期研究發現，下丘腦室旁核小膠質細胞活化可能參與了新生期母嬰分離致成年小鼠內臟痛敏反應[8]。因此，膠質細胞在慢性疼痛易化過程中同樣起著重要作用，而室旁核膠質細胞活化參與炎性痛反應的研究甚少。

炎癥性疼痛是一種組織損傷性應激反應，下丘腦室旁核(paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN)在應激及疼痛調節中發揮著重要的作用[9]。本研究采用完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvannt，CFA)誘導的炎性痛模型，采用免疫熒光方法檢測炎性痛條件下，PVN中小膠質細胞和星形膠質細胞活化情況，進一步通過小膠質細胞特異性抑制劑米諾環素作用后，觀察其熱痛行為學改變，為進一步理解炎性痛的發病機制及探討室旁核膠質細胞活化在炎性痛過程中的作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康成年SD大鼠34只，♂，體質量230～250 g，由山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK(魯)20140007。大鼠置于晝夜(12 h/12 h)節律光照條件下，室溫(23±1)℃，自由飲水和攝食，所有大鼠實驗前靜養1周。所有實驗均遵守《實驗動物使用規范》。

1.1.2試劑與儀器 鈣離子接頭蛋白1(ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba1)抗體(lot:GR264097-1)購自Abcam公司；膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(lot：2110541)購自Millipore；米諾環素(lot # BCBG8005V)、CFA均購自Sigma。熱痛敏刺激儀(IITC series 8-390)購自中國醫學科學院生物工程研究所。

1.2CFA炎癥性疼痛模型的制備及實驗分組輕輕固定大鼠，用微量注射器吸取100 μL CFA注入大鼠左側后肢足底中心皮下，建立炎癥性疼痛模型；生理鹽水對照組于相同位置注射100 μL生理鹽水。模型建立成功的標志為大鼠局部出現典型的外周炎癥癥狀，包括注射局部紅、腫以及疼痛表現等，持續時間超過1周。

將SD大鼠隨機分為兩組：生理鹽水對照組(Control)組，即0.9% NS(100 μL)皮下注射；CFA組即CFA皮下注射，注射部位均為左后肢足底中心皮下。根據免疫熒光結果，在CFA炎癥性疼痛模型建立后，對大鼠進行PVN給藥，分為室旁核微量注射生理鹽水(NS)組和給藥(米諾環素)組，每組6只大鼠，NS組為PVN微量注射0.9% NS 0.5 μL；米諾環素組為微量注射米諾環素(0.4 g·L-1)0.5 μL。

1.3PVN注射CFA致炎后d 1、6，大鼠七氟烷吸入麻醉后，頭部固定于大鼠腦立體定位儀上，暴露顱骨，30% H2O2清潔顱骨表面，參考Watson &Paxinos大鼠腦圖譜，結合本課題組對大鼠(230～250 g)PVN核團定位摸索，確定核團坐標為：ML=±0.4 mm，AP=-1.4 mm，DV=7.7 mm[9]。用針尖外徑為0.3 mm的微量注射器向核團內注射，1 min內注射完畢，留針5 min以防藥液反流，統一選取右側PVN進行注射：米諾環素(0.4 g·L-1)0.5 μL。注射后0.5、1、2、3、4 h檢測熱痛閾。

1.4熱縮足反射潛伏期(thermalwithdrawallatency,TWL)測定在同一時間段、同一室溫、同一濕度下進行測定。按照Hargreaves法，將大鼠放置于3 mm厚的15 cm×15cm×15 cm的有機玻璃箱中，待大鼠在其中適應30 min安靜后，用熱痛敏刺激儀照射大鼠左后肢足底后外側。從照射開始至大鼠出現抬腿回避的時間為TWL；光源刺激強度恒定不變，自動切斷時間為25 s，以防止組織損傷。每只動物連續測定5次，測量間隔3 min，取其中3次比較平穩的數據平均值為大鼠TWL。

1.5免疫熒光(immunofluorescence，IF)檢測10%水合氯醛(3 mL·kg-1)大鼠腹腔注射麻醉后，灌注取腦，放入4%的多聚甲醛中，于4℃固定4～6 h，然后放入30%蔗糖中大約2 d，待組織塊沉底后，作冰凍冠狀連續切片，片厚30 μm，切片PBS漂洗后，放入一抗Iba1(1 ∶200)、GFAP(1 ∶200)中，4℃孵育過夜，TBS漂洗3次后，加入相應的二抗，避光常溫孵育2 h，TBS漂洗后貼片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察，拍片。Image-Pro Plus軟件分析計算室旁核Iba1和GFAP陽性表達的細胞數目。

2 結果

2.1CFA炎性痛大鼠PVN小膠質細胞和星形膠質細胞的活化情況如Fig 1所示，與對照組相比，CFA炎性痛大鼠PVN小膠質細胞于d 1開始明顯活化，于d 14仍處于活化狀態(P<0.01)；星形膠質細胞于d 3開始明顯活化，于d 14同樣處于活化狀態(P<0.01)。

2.2CFA炎性痛急性期PVN注射米諾環素對熱痛行為學的影響CFA炎性痛大鼠于d 1急性期，PVN內微量注射小膠質細胞特異性抑制劑米諾環素(0.4 g·L-1)0.5 μL 2 h后，活化的小膠質細胞受抑制程度最大，且所需米諾環素劑量最低(Fig 2A)，因此，認為此劑量為藥物的最適劑量。與NS組相比，米諾環素組大鼠的TWL于1、2、3 h明顯升高(P<0.05)，于4 h衰減到給藥前水平(Fig 2B)。

2.3CFA炎性痛慢性期PVN注射米諾環素對熱痛行為學及膠質細胞活化的影響CFA炎性痛大鼠于d 6進入慢性期，PVN內微量注射米諾環素后，與NS組相比，米諾環素組大鼠的TWL無明顯變化(Fig 3A)；并在給藥后2 h，室旁核小膠質細胞活化明顯被抑制，星形膠質細胞仍處于活化狀態(Fig 3B)。

3 討論

以往研究表明，在疼痛調節過程中，神經元及神經環路發揮了重要作用，而膠質細胞只起著支持、營養神經元的作用。然而，最近的研究表明，膠質細胞在疼痛調節過程中同樣發揮了重要作用，比如傷害性刺激激活外周感覺神經元，進一步傳入脊髓，可致脊髓小膠質細胞膜上嘌呤受體P2X4R表達上調，從而促進胞內信號分子傳導，增加腦源性神經營養因子BDNF的釋放，釋放的BDNF可促進脊髓Ⅰ層神經元過度興奮，增強疼痛反應[10]；星形膠質細胞可以通過胞內激酶、縫隙連接通道、胞膜受體、轉運體以及釋放的炎癥介質等，參與疼痛調節反應，并且這一作用主要與慢性疼痛的維持有關[11]。

Fig 1 Activation of microglia(A) andastrocytes(B) in PVN in CFA treated rats

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs1 d group;△P<0.05,△△P<0.01vs3 d group

Fig 2 Changes of activation of microglia and TWL afterinjecting microglia specific inhibitor minocycline in PVN onthe 1st day post CFA injection

Fig 3 Changes of TWL and activation of microgliaand astrocytes after injecting minocyclinein PVN on the 6th day post CFA injection

本課題組前期研究發現，PVN小膠質細胞胞膜上Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)參與新生期母嬰分離致成年小鼠慢性內臟痛的過程。這一作用可能和生命早期應激致成年小鼠室旁核小膠質細胞活化有關，活化的小膠質細胞可以釋放大量IL-1β、TNF-α等炎癥因子，可致大腦區域性對氧化應激產生易感狀態，敏化促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing factor，CRF)神經元，進而激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，參與內臟痛敏反應[8]。雖然中樞神經系統膠質細胞參與疼痛的調節有很多報道，但室旁核中表達的膠質細胞對炎癥性疼痛的調節作用還知之甚少。本研究中，通過CFA足底注射后，可誘導明顯的炎性痛模型，并在急性期d 1，室旁核小膠質細胞明顯活化，一直持續到d 14仍處于活化狀態；d 3進入亞急性期，室旁核星形膠質細胞開始明顯活化，持續到d 14同樣仍處于活化狀態，這與有關報道小膠質細胞激活早于星形膠質細胞的結論相一致[12]。實驗于致炎后d 1，室旁核微量注射小膠質細胞特異性抑制劑米諾環素后，小膠質細胞活化明顯受到抑制，且可明顯減輕大鼠熱痛敏反應，說明小膠質細胞參與調節了炎癥性疼痛急性期熱痛敏反應。致炎后d 6，進入慢性期，室旁核微量注射米諾環素后，小膠質細胞活化同樣明顯受到抑制，但不能明顯減輕大鼠熱痛敏反應，而此時星形膠質細胞仍處于明顯活化狀態。因此認為室旁核小膠質細胞激活可能主要參與炎性痛敏的形成，而在慢性期小膠質細胞仍處于持續活化狀態，可能與此時星形膠質細胞的持續活化刺激有關，同樣持續活化的小膠質細胞也可以通過分泌相關炎性因子，促進星形膠質細胞的持續激活，且星形膠質細胞的持續激活對炎性痛敏的維持可能更具意義。

PVN在應激及疼痛調節中發揮了重要作用[9]，當CFA致炎后，外周傷害性刺激激活信號傳入中樞，在急性期，可誘發PVN小膠質細胞活化，活化的小膠質細胞可大量釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子或趨化因子，促使室旁核神經元激活，導致室旁核對外周炎癥性痛刺激反應性增強。在亞急性期，室旁核星形膠質細胞明顯活化，活化的星形膠質細胞不僅可以分泌炎癥介質和興奮性神經遞質，如谷氨酸、乙酰膽堿等，興奮鄰近的神經元，而且可以包裹神經元突觸，與神經元突觸產生有效的直接聯系，調節神經元突觸傳導作用[13]。并且當疼痛相關神經遞質激活星形膠質細胞時，激活的星形膠質細胞可以通過大量的縫隙連接，以鈣波形式向外傳播，激活鄰近或者遠處的星形膠質細胞，促使痛相關神經遞質大量釋放，調節疼痛反應[14]，這可能與星形膠質細胞參與慢性疼痛過程的維持有關。本研究將為臨床炎性痛的治療提供一定的理論基礎和治療靶點。