白花丹素對人類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡的影響

劉 玉，朱德強，高 薇

(錦州醫科大學1. 附屬第一醫院風濕免疫科、2. 基礎醫學院病理與病理生理教研室，遼寧 錦州 121000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)為進展性的自身免疫性疾病，以關節滑膜組織內反復發作的慢性炎癥為主要病理特征，并逐漸浸潤關節內軟骨和軟骨下骨質，嚴重可以累及患者全身多個大小關節、器官和系統，發病率和致殘率較高。大量文獻證實，滑膜細胞在RA病程中呈類腫瘤性異常增殖，并侵入到軟骨和骨，產生多種致炎因子，導致軟骨和骨內慢性炎癥。成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)是RA病程中的主要效應細胞之一，其過度增殖及凋亡不足在關節破壞和慢性持續性炎癥中起關鍵性作用[1-2]。因此，誘導關節內FLSs凋亡，抑制其增殖，在RA的臨床治療中至關重要。

臨床上多采用來氟米特、甲氨喋呤等免疫抑制劑及靶向生物制劑治療RA[3]，但是其副作用和不良反應多，并且生物制劑價格昂貴，給患者造成了巨大的負擔，延誤了疾病的治療。因此，研制高效、副作用小的抗RA新藥勢在必行。近年來，中藥單體得到越來越多的關注，為治療RA提供了新方法。白花丹素(plumbagin，PLB)的結構見Fig 1，為中藥單體，提取自中藥白花丹根和莖中，已有研究表明，PLB有抗腫瘤[4]、抑制肝纖維化[5]、抑制炎癥[6]、抑菌[7]等多種效應，且在低濃度時對正常細胞毒性相對較小，但有一定的肝毒性[8]。近年來，PLB治療炎癥性疾病的作用受到越來越多的關注。本研究觀察PLB對RA患者FLSs凋亡的影響，探討PLB用于RA治療的可行性。

Fig 1 Chemical structural formula of PLB

1 材料

1.1滑膜組織標本人滑膜組織標本取自錦州醫科大學附屬第一醫院2016年11月-2017年9月骨關節外科，行關節鏡滑膜切除的活動期RA患者關節內切取的病變滑膜組織，患者癥狀符合美國風濕病協會(ACR)1987年修訂的診斷標準，標本采集術前已獲得患者知情同意。

1.2試劑白花丹素單體(純度97%，CAS號：481-42-5，產品編號：P7262，分子質量：188.18)、LPS(產品編號：L2880)購自美國Sigma公司；甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)，CAS號：59-05-2，購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清(FBS)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Hyclone公司；細胞凋亡試劑盒購自美國BD公司；Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、p-JAK2、p-STAT3、GAPDH兔單抗，細胞凋亡Hoechst 33342染色試劑盒，均購自美國Cell Signaling Technology公司；抗血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecular 1，VCAM-1)兔單抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗、人 TNF-α ELISA試劑盒、人IL-6 ELISA 試劑盒、ECL Plus試劑盒，均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3儀器倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；CO2培養箱(日本SANYO公司)；酶標儀(美國Bio-Rad公司)；流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)。

2 方法

2.1RA患者關節FLSs的分離及培養將在無菌條件下分離的滑膜組織，浸入含DMEM高糖培養基的離心管，在0.5 h內采用酶消化法對滑膜組織進行處理：除去脂肪、纖維組織、血管等，無菌PBS反復沖洗5次，然后用高溫高壓滅菌的眼科剪將滑膜組織盡量粉碎成2～3 mm3小塊，0.4%Ⅱ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶分別于37℃、5% CO2培養箱中消化2、0.5 h，加血清終止消化。紗網過濾，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清，加20% FBS培養基重懸，混勻，接種至培養瓶內培養，24 h后換液，棄去未貼壁細胞，余下細胞長滿后傳代。待傳代3次后，可見長梭形或菱形，呈巢狀生長的FLSs，約占98%以上，取第3代細胞進行細胞鑒定，第4～7代進行實驗。

2.2FLSs的鑒定取第3代細胞接種至6孔板中，每孔預先鋪好蓋玻片，待每孔細胞長至約70%時，吸出培養液， PBS漂洗后，4%多聚甲醛固定液4℃固定過夜，PBS洗去固定液，0.5% Triton X-100室溫通透20 min，PBS漂洗3次，每次5 min，吸盡液體，封閉液封閉1 h，去封閉液，用1 ∶200稀釋的抗VCAM-1一抗置于濕盒內4℃孵育過夜，PBS洗滌去除一抗，吸盡液體，滴加1 ∶1 000稀釋的二抗，濕盒內避光孵育1 h，PBS洗滌3次，避光操作，DAPI避光孵育5 min，PBST洗滌5次，每次5 min，吸盡液體，滴加抗熒光淬滅封片液于載玻片，蓋上貼有細胞的蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.3MTT法檢測RAFLSs活力及增殖能力將RA患者第4～7代的FLSs均勻鋪至96孔板，每孔約6×103個細胞。置于37℃、5% CO2的細胞培養箱內培養，細胞貼壁后，將其分組：第1組為空白對照組(Control組)，第2～4組為PLB組(0.5、1.5、3 μmol·L-1PLB處理細胞)，第5組為模型組(1 mg·L-1LPS處理細胞)，第6～11組為LPS+PLB處理組(1 mg·L-1LPS+0.5、1.5、3、5、7.5、10 μmol·L-1PLB處理細胞)，第12組為LPS+MTX處理組(1 mg·L-1LPS+ MTX 1.0 mg·L-1)。藥物作用24 h后，加入MTT溶液，37℃、5% CO2孵育4 h ，輕輕抽掉培養液，每孔加入100 μL DMSO，室溫震蕩溶解甲臜結晶，用酶標儀檢測490 nm處的OD值。本實驗重復6次,每次每組設置5個復孔。

2.4ELISA檢測RAFLSs致炎因子的分泌量將第5～7代RA FLSs接種在96孔板，每孔約6×103個細胞，置于37℃、5% CO2孵箱中培養24 h，將細胞分為5組：對照組、模型組(1 mg·L-1LPS)、LPS+0.5 μmol·L-1PLB組、LPS+3 μmol·L-1PLB組、LPS+1.0 mg·L-1MTX組。24 h后收集各組細胞培養液，10 000×g離心5 min以去除雜質，按照ELISA說明書操作，酶標儀檢測各組OD值。根據繪制好的標準蛋白曲線，計算各組細胞培養液上清TNF-α、IL-6的濃度。

2.5克隆形成實驗檢測RAFLSs的克隆形成能力取第4～7代FLSs，鋪6孔培養板，每孔細胞約5×105個，根據上述分5組用藥物處理。藥物作用時間2周，期間每3 d換液1次，并保證藥物濃度不變。然后用PBS輕輕漂洗2次；5%的甲醛固定30 min，PBS輕輕漂洗3次；結晶紫染色30 min，PBS漂洗3次；晾干,相機拍照。

2.6Hoechst33342染色法觀察RAFLSs細胞核的凋亡形態按說明書處理的蓋玻片放入6孔板中，取第4～7代的FLSs，均勻鋪至6孔板內，每孔內細胞密度約80%時，按上述分成5組處理。24 h后吸出孔內液體，固定，PBS漂洗，每孔0.5 mL Hoechst 33342染色液染色20 min，PBS輕輕沖洗3次，封片，用熒光顯微鏡隨機選擇不同區域觀察并拍照。活力較強的細胞胞核為微弱熒光，凋亡細胞的核呈濃染的藍色熒光。

2.7流式細胞術(flowcytometry，FCM)檢測RAFLSs凋亡率取第4～7代的FLSs，均勻接種到6孔培養板中培養，分組同上。藥物處理24 h后消化、離心，預冷PBS重懸，將細胞密度調至1×108·L-1，按Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書染色，流式細胞儀上機檢測。

2.8Westernblot檢測相關蛋白表達提取細胞蛋白，各組藥物作用24 h后，消化、離心；RIPA裂解液處理細胞，4℃、12 000×g離心25 min；按BCA定量說明書進行蛋白定量，根據定量結果配制樣品，樣品100℃水浴5 min；SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉至PVDF膜上，留取目標條帶；1%的BSA封閉1 h；一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，TBST漂洗3次；二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL顯影，本實驗重復3次。

3 結果

3.1RA患者FLSs形態鑒定RA FLSs培養2 d觀察到少量散在的FLSs已貼壁(Fig 2A)。1周后有少量集落形成，細胞數目明顯增多，細胞之間有明顯空隙，形態為長梭形、菱形、三角形(Fig 2B)，換液，繼續培養2 d(Fig 2C)傳代，經2～3代后細胞形態均一，鏡下觀察細胞形態為長梭形，與相鄰細胞相互交織，呈巢狀生長，符合FLSs形態。

3.2RAFLSs細胞標志物鑒定Fig 3的免疫熒光結果顯示，分離培養得到的第3代滑膜細胞標志物VCAM-1均呈陽性表達，而其他組織來源的成纖維細胞VCAM-1均為陰性表達，故本實驗分離培養得到的細胞均為FLSs，符合實驗要求。

3.3PLB對RAFLSs活力及增殖能力的影響如Fig 4所示，單獨PLB處理組(0.5、1.5、3 μmol·L-1)與對照組相比，RA FLSs活力差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組(1 mg·L-1LPS)相比，LPS+PLB組、LPS+MTX組細胞活力明顯降低(P<0.05)，PLB對細胞增殖的抑制能力呈濃度依賴性。說明0.5、1.5、3 μmol·L-1PLB對對照組細胞活力無明顯影響，對LPS誘導的炎癥細胞有明顯的抑制作用。PLB對LPS炎癥誘導細胞的抑制率IC50為3.149 μmol·L-1，故選擇濃度為0.5、3 μmol·L-1PLB處理細胞24 h進行后續實驗，以MTX處理細胞作為陽性對照。

3.4PLB對LPS誘導的RAFLSs致炎介質分泌的影響Fig 5的ELISA結果顯示，與對照組相比，模型組上清中TNF-α、IL-6濃度均明顯增高(P<0.01)，說明造模成功；LPS+PLB處理組及LPS+MTX處理組TNF-α、IL-6水平與模型組相比明顯降低，說明PLB與MTX能抑制LPS誘導的炎癥因子的分泌。

Fig 2 Synovial fibroblasts isolated by enzyme digestion method in patients with rheumatoid arthritis(×200)

Fig 3 Expression of VCAM-1 in RA FLSs by immunofluorescence staining(×200)

Fig 4 Effect of PLB on viability of RA

1:Control group;2:0.5 μmol·L-1PLB;3:1.5 μmol·L-1PLB;4:3.0 μmol·L-1PLB;5:Model group (1 mg·L-1LPS);6:LPS+0.5 μmol·L-1PLB;7:LPS+1.5 μmol·L-1PLB;8:LPS+3.0 μmol·L-1PLB;9:LPS+5.0 μmol·L-1PLB;10:LPS+7.5 μmol·L-1PLB;11:LPS+10 μmol·L-1PLB;12:LPS+MTX(1 mg·L-1).##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

Fig 5 Inhibitory effect of PLB on LPS- induced TNF-α(A)and IL-6 (B) levels in RA

1:Control;2:Model;3:LPS+0.5 μmol·L-1PLB;4:LPS+3.0 μmol·L-1PLB;5:LPS+1.0 mg·L-1MTX.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

3.5PLB對RAFLSs克隆形成能力的影響如Fig 6所示，以對照組細胞克隆形成能力為100%，模型組增殖能力增強，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，LPS+PLB處理組及LPS+MTX處理組細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)。

Fig 6 Effect of PLB on colony-formation ability

1:Control;2:Model;3:LPS+0.5 μmol·L-1PLB;4:LPS+3.0 μmol·L-1PLB;5:LPS+1.0 mg·L-1MTX. A：The density of RA FLSs captured by camera;B:Bar graph of proliferation rate in RA FLSs.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.0 1vsmodel group.

3.6PLB對RAFLSs凋亡的影響Hoechst 33342染色時，一般正常細胞胞核在熒光顯微鏡下觀察呈微弱淡藍色熒光，凋亡細胞核呈致密濃染的亮藍色熒光。如Fig 7所示，對照組FLSs核呈微弱熒光，模型組較對照組胞核熒光更弱，1 mg·L-1LPS+ PLB(0.5、3 μmol·L-1)組較模型組胞核熒光增強，且與PLB濃度呈正比；LPS+MTX處理組細胞核熒光較模型組增強。各組細胞凋亡率如Fig 8所示，與模型組相比，LPS+PLB組及LPS+MTX組細胞凋亡率明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。

3.7PLB對凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、cleavedcaspase-3表達的影響與對照組相比，模型組Bcl-2表達明顯增多 (P<0.01)，Bax、cleaved caspase-3表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組相比，不同濃度PLB處理組及MTX處理組Bax、cleaved caspase-3蛋白表達增高,Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)。LPS+3 μmol·L-1PLB組較LPS+0.5 μmol·L-1PLB組Bax、cleaved caspase-3表達增多，Bcl-2蛋白表達降低。見Fig 9。

3.8PLB抑制JAK2/STAT3信號轉導通路如Fig 10所示，與對照組相比，模型組p-JAK2、p-STAT3表達增多，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，不同濃度PLB處理組及MTX處理組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達降低(P<0.05)。LPS+3 μmol·L-1PLB組較LPS+0.5 μmol·L-1PLB組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達降低。

Fig 7 Effects of PLB on nuclear morphometry change of RA FLSs(×200)

Fig 8 Effects of PLB on apoptosis of RA

Fig 9 Effect of PLB on expression of Bax,Bcl-2 andcleaved caspase-3 proteins of RA

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

Fig 10 Effect of PLB on expression of p-JAK2,p-STAT3proteins of RA

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

4 討論

RA作為一種臨床比較常見的風濕性疾病，其病理改變為關節腔內滑膜炎、血管翳形成，滑膜細胞類腫瘤樣增生，并能逐漸侵蝕關節軟骨和骨，最終可能導致關節畸形和功能喪失[1]。正常人關節滑膜襯里層由1～2層滑膜細胞構成，而RA患者關節滑膜襯里層滑膜細胞可過度增殖成多層。滑膜細胞主要有FLSs及巨噬細胞樣滑膜細胞，FLSs呈長梭形[9]，FLSs為RA患者病程中的主要效應細胞[2]。因此，促進FLSs凋亡可以有效減輕RA患者的關節炎癥狀，延緩疾病進展，降低致殘率。本研究細胞形態及細胞生物標記物鑒定結果顯示，在體外分離培養RA患者關節內的FLSs呈長梭形，且第3代RA FLSs表達VCAM-1陽性，證實了本實驗中所用細胞均為RA FLSs。本實驗選用LPS處理RA FLSs以模擬細胞在患者體內的長期慢性炎癥環境[10]，ELISA檢測結果顯示，模型組炎癥介質分泌較空白組增多，說明細胞造模成功，MTT和集落形成實驗結果進一步顯示，PLB能明顯抑制LPS誘導后的RA FLSs的增殖活力，本研究均在此模型基礎上進行。

目前已知的細胞凋亡通路有多種，線粒體在細胞凋亡中處于凋亡調控的重要位置。Bcl-2家族的凋亡相關蛋白，如Bcl-2、Bax、Bcl-xl等都定位于線粒體膜上，它們都能阻止或促進線粒體內Cyt C的釋放，進而引發caspase級聯反應，誘導細胞凋亡[11]。本研究Hoechst 33342染色實驗結果證實，PLB能促進細胞核各種凋亡形態的產生，流式實驗結果也顯示，PLB能促進RA FLSs的凋亡。Western blot實驗進一步說明，PLB能抑制RA FLSs中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，并使促凋亡蛋白Bax、凋亡下游執行因子cleaved caspase-3蛋白的表達增加，從而促進RA FLSs凋亡。

有研究表明，JAK/STATs信號通路是重要的細胞因子轉導通路，也是人體內調節細胞增殖、分化、凋亡等許多生理和病理過程的共同通路之一。JAK/STATs信號通路被激活時，首先JAK蛋白相互磷酸化，再激活STATs蛋白，其中激活態的p-STAT3蛋白有明顯抑制FLSs、巨噬細胞凋亡的作用，與其最密切的上游蛋白即為JAK2[12-14]。經證實，在體外培養的 RA FLSs中，JAK/STATs信號通路被大量激活，Bcl-2處于高表達的狀態，Bax、cleaved caspase-3均處于低表達水平，在特異性阻斷STAT3通路后，Bcl-2基因及蛋白水平明顯降低，Bax、cleaved caspase-3表達水平相應上升[15]，因此，抑制JAK2/STAT3通路可以促進RA FLSs的凋亡。本研究發現，PLB處理RA FLSs細胞后，p-JAK2、p-STAT3蛋白量明顯降低，說明PLB能明顯抑制JAK2/STAT3信號通路的傳導。

綜上所述，本實驗證明PLB對RA FLSs有促凋亡作用，其機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路有關，并進一步證實了PLB對RA的治療價值。本研究只說明了PLB能夠抑制JAK2/STAT3信號通路，并通過降低Bcl-2蛋白的表達，促進RA FLSs凋亡，其中具體的聯系還有待進一步研究。目前，已有很多PLB應用于其他腫瘤疾病及關節炎的動物體內研究，為下一步探討PLB作用于RA的信號通路研究提供了指導。

(致謝：本實驗于錦州醫科大學附屬第一醫院骨科實驗室完成，感謝實驗室老師和同學的指導和幫助！)