饑餓對Beclin-1依賴的Ana-1細胞自噬和凋亡的影響

楊萬霞，蘇 強，邢愛華,張曉延

(1．蘭州大學第二醫院檢驗科，甘肅 蘭州 730000；2．山西醫科大學汾陽學院醫學檢驗系，山西 汾陽 032200；3．山西醫科大學第一醫院神經內科，山西 太原 030001；4．山西醫科大學藥學院，山西 太原 030001)

自噬是真核細胞特有的保守性細胞應激信號通路，主要將細胞內受損細胞器或蛋白等運輸至溶酶體進行降解和循環利用，以此維持細胞內環境穩態[1-2]。Beclin-1是自噬啟動的關鍵蛋白之一，參與早期自噬體膜的形成，并可通過與Bcl-2結合調控自噬和凋亡的發生[3-4]。自噬的失調與多種疾病的發生發展有關[5]。機體在饑餓、氧化應激等條件下可通過誘導自噬來維持正常免疫功能[6-7]。國內外研究大多聚焦于自噬參與腫瘤、病毒感染的發生發展，而有關自噬與免疫細胞的研究鮮有報道。本研究探討饑餓對小鼠巨噬細胞Ana-1自噬和凋亡的影響，以及自噬相關蛋白Beclin-1在此過程中發揮的作用，為進一步了解免疫細胞發生自噬、凋亡及其相互調控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、材料和儀器Ana-1細胞購于中科院上海細胞生物研究所。RPMI 1640培養基、HRP標記的羊抗鼠和羊抗兔二抗及通用蛋白裂解液購自武漢博士德生物工程有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，3-甲基腺嘌呤(3-MA)購自美國Selleck公司，β-actin抗體、Beclin-1抗體、LC3抗體和Caspase-3抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，ECL化學發光劑購自美國Millipore公司。電泳儀、垂直電泳槽和轉印模塊購自美國Bio-Rad公司，酶標儀(Eon)購自美國BioTek公司，熒光顯微鏡(DM4000)購自德國Leica公司。

1.2 細胞培養和傳代小鼠巨噬細胞Ana-1接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養基中，在37℃、含5% CO2的培養箱中培養，每隔12～24 h更換新鮮培養液，待細胞長至80%～90%融合時，進行傳代。

1.3 Ana-1細胞分組和干預方法為觀察饑餓對Ana-1細胞自噬和凋亡的影響，將生長至對數生長期的細胞接種于不含血清、含1%青鏈霉素的RPMI 1640培養基中培養，分別饑餓0 h(對照組)和3、6、9、12、24 h(饑餓組)，采用Western blotting法檢測Ana-1細胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值(饑餓6、12和24 h組)和Beclin-1、Caspase-3蛋白表達水平(饑餓3、6、9、12和24 h組)，倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態表現。為研究饑餓誘導自噬和凋亡的機制，將細胞分為空白對照組、饑餓組、3-MA(10 μmol·L-1)組和3-MA(10 μmol·L-1)聯合饑餓組，各組細胞共同培養24 h，采用Western blotting法檢測各組Ana-1細胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表達水平及Caspase-3蛋白水平。

1.4 Western blotting法檢測各組Ana-1細胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表達水平及Caspase-3蛋白水平離心收集各組細胞，加入通用細胞裂解液，裂解提取蛋白，BCA法定量并調齊蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液經煮沸5 min，使蛋白變性。細胞總蛋白質經12% SDS-PAGE電泳分離，并用濕法轉移到NC膜上；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別在對應位置孵育LC3抗體(1∶1 500)、Caspase-3抗體(1∶3 000)和β-actin抗體(1∶1 500)，4℃過夜；TBST洗滌3次，每次10 min；HRP標記的羊抗兔和羊抗鼠的二抗(1∶5 000)室溫孵育2.5 h，TBST洗滌3次；ECL底物顯色、曝光、顯影、定影后分析蛋白條帶的顯色結果。采用Image J軟件進行灰度值分析。Beclin-1蛋白表達水平和Caspase-3蛋白水平=每個樣本條帶灰度值/β-actin灰度值。

2 結 果

2.1 各組Ana-1細胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值與對照組比較，饑餓6、12和24 h組Ana-1細胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ 比值明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且呈時間依賴性。見圖1和表1。

Lane 1：Control group；Lane 2-4：6,12, and 24 h starvation groups.

圖1 Western blotting法檢測各組Ana-1細胞中LC3蛋白電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of LC3 proteins in Ana-1 cells in various groups measured by Western blotting method

表1 各組Ana-1細胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ 比值

GroupLC3-Ⅱ/ LC3-ⅠControl9.816±0.552Starvation(t/h) 611.199±0.375? 12 12.329±0.452?? 24 13.479±0.937??

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group.

2.2 各組Ana-1細胞中Beclin-1蛋白表達水平和Caspase-3蛋白水平 與對照組比較，饑餓6、9、12和24 h組Ana-1細胞中Beclin-1蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，饑餓12和24 h組Ana-1細胞中Caspase-3蛋白水平明顯降低(P<0.01)，且呈時間依賴性。見圖2和表2。

Lane 1：Control group；Lane 2-6：3，6，9，12， and 24 h starvation groups.

圖2 各組Ana-1細胞中Beclin-1和Caspase-3蛋白電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of Beclin-1 and Caspase-3 proteins in Ana-1 cells in various groups

表2 各組Ana-1細胞中Beclin-1蛋白表達水平和Caspase-3蛋白水平

GroupBeclin-1Caspase-3Control0.523±0.0270.916±0.058Starvation(t/h) 30.574±0.0100.876±0.073 60.631±0.040?0.814±0.063 90.653±0.022?0.791±0.027 120.686±0.025? 0.729±0.033? 240.772±0.035? 0.704±0.016?

*P<0.01 compared with control group.

2.3 各組Ana-1細胞的形態表現 饑餓處理Ana-1細胞不同時間后，與對照組比較，饑餓組細胞形態發生改變，出現細胞皺縮和碎片，隨著時間的延長，細胞形態變化明顯。見圖3。

A-C:Control group;D-F:Starvation group;A,D:6 h;B,E:12 h;C,F:24 h.

2.4 饑餓誘導自噬和凋亡的機制實驗中各組Ana-1細胞LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表達水平及Caspase-3蛋白水平 與空白對照組比較，饑餓組Ana-1細胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin-1 蛋白表達水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，Caspase-3蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與饑餓組比較，3-MA聯合饑餓組Ana-1細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1 蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，Caspase-3蛋白水平也明顯降低(P<0.05)。見圖4和表3。

3 討 論

Lane 1：Blank control group；Lane 2：Starvation group；Lane 3：3-MA(10 μmol·L-1)group；Lane 4：3-MA(10 μmol·L-1)combined with starvation group.

圖4 各組Ana-1細胞中LC3-Ⅱ、 LC3-Ⅰ、Beclin-1和Caspase-3蛋白電泳圖

Fig.4 Electrophoregram of LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ， Beclin-1 and Caspase-3 proteins in Ana-1 cells in various groups

表3 各組Ana-1細胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表達水平及Caspase-3蛋白水平

GroupLC3-Ⅱ/ LC3-ⅠBeclin-1Caspase-3Blank control1.803±0.1090.484±0.0161.713±0.098Starvation2.328±0.132?0.578±0.010??1.484±0.054?3-MA2.342±0.2730.624±0.0111.553±0.0523-MA combined with starvation1.554±0.099△△0.411±0.018△△1.295±0.032△

*P<0.05，**P<0.01 compared with blank control group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with starvation group.

免疫系統的免疫防御、監視和自穩功能是維持機體內環境穩定及生理平衡的重要保障，自噬是生物進化過程中保留下來的高度保守的自我保護機制，Beclin-1基因是第一個被確認的哺乳動物自噬基因，對自噬體的形成至關重要[8]。目前關于免疫細胞自噬的研究較少，因此本研究致力探討饑餓對小鼠巨噬細胞Ana-1自噬和凋亡的影響，分析自噬關鍵蛋白Beclin-1在此過程中發揮的作用。

1998年Liang等[9-10]在致死性Sinbis病毒性腦炎的大鼠體內發現了Beclin-1基因，Beclin-1是酵母自噬相關基因Atg6/Vps30的哺乳動物同源基因，位于人染色體17q21位點，主要通過參與組成Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3KⅢ)復合體募集胞漿中其他自噬相關蛋白，形成蛋白復合體，促進自噬體膜的發生[11-12]。本研究結果顯示：在體外，饑餓可以有效地促進Ana-1細胞自噬，隨著饑餓時間的延長，LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值升高，與饑餓促進成骨細胞MC3T3-E1自噬的研究[13]結果相似；Beclin-1的表達水平也隨著饑餓時間的延長而增加，推測Beclin-1可能參與了饑餓誘導的Ana-1細胞自噬。為研究饑餓誘導的自噬與Beclin-1的關系，本研究采用細胞自噬抑制劑3-MA抑制自噬，結果顯示：LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表達水平明顯降低，表明饑餓誘導的Ana-1細胞自噬是以Beclin-1依賴的方式進行的，這與3-MA抑制Beclin-1而抑制自噬體的形成[14]相一致。

本研究結果還顯示：在體外，饑餓可以誘導Ana-1細胞發生凋亡，饑餓處理后，鏡下可見細胞開始皺縮、出現碎片，這種變化隨著饑餓時間的延長而加重，另外，Caspase-3水平也明顯降低，推斷饑餓誘導了Ana-1細胞凋亡的發生，與饑餓下調Bcl-2/Bax從而誘導舌鱗狀細胞癌細胞Tca8113凋亡[15]的研究一致。大量研究[16-18]結果顯示：Beclin-1與自噬和凋亡的調節均有關聯，凋亡抑制因子Bcl-2通過與Beclin-1相互作用抑制蛋白復合物的形成，從而阻止饑餓介導的Beclin-1依賴的細胞自噬的發生。為研究饑餓誘導的Ana-1細胞凋亡與Beclin-1的關系，本研究采用3-MA處理細胞，結果顯示：3-MA對饑餓誘導的Caspase-3蛋白降解無抑制作用，反而有促進作用，與Beclin-1的變化不一致，表明饑餓誘導的Ana-1細胞Caspase-3蛋白降解并不依賴于Beclin-1。本研究結果與饑餓狀態下3-MA間接促進心肌細胞凋亡[19]和3-MA可增強CPT對HeLa細胞凋亡的敏感性[20]等研究一致。Wirawan等[21]發現：Beclin-1是Caspase的一種底物，Caspase蛋白酶可剪切Beclin-1，形成N端和C端2個主要片段，剪切后的Beclin-1失去自噬啟動作用，同時C端片段可以促進線粒體釋放促凋亡基因。自噬和凋亡之間存在著錯綜復雜的關系，如毛地黃黃酮可通過促進巨噬細胞自噬來減弱凋亡[22]。

綜上所述，饑餓可誘導Ana-1細胞發生Beclin-1依賴的自噬并引起細胞凋亡，本研究結果為外界壓力刺激下免疫細胞通過對自噬和凋亡相互調控的研究提供了參考，但其具體機制還有待進一步實驗證明。