線粒體靶向KillerRed誘導的ROS增強輻射對HeLa細胞的增殖抑制作用

李 鑫，馬云飛，唐 庚，韋 麒，紀紅池，田嘉安，申延男，王志成

(吉林大學公共衛生學院 國家衛生健康委員會放射生物學重點實驗室，吉林 長春 130021)

宮頸癌是嚴重威脅健康與生命的最常見的婦科惡性腫瘤，發展中國家宮頸癌病例數約占全球宮頸癌的85%[1-2]。放射治療(簡稱放療)是宮頸癌常用的治療手段之一，通過誘導宮頸癌細胞凋亡可以增強其放療效果。活性氧(reative oxygen species，ROS)是一組高活性的氧分子及其衍生物，在生理條件下，低水平ROS的生成被認為是信號分子，但過量ROS則會誘導氧化損傷，導致腫瘤細胞凋亡或壞死[3-5]。線粒體既是ROS的產生部位，也是ROS的作用靶點。ROS作用線粒體后，可以誘導線粒體損傷，進而導致細胞凋亡。KillerRed(KR)蛋白是一種能夠產生紅色熒光以二聚體形式存在的蛋白，在540 ～ 580 nm光照時可以產生致細胞損傷的ROS，同時使蛋白失去活性[6-7]。本文作者利用線粒體靶向蛋白選擇性雄激素受體調節劑1(selective androgen receptor modulator 1，Sarm1)的線粒體定位序列與KR形成融合蛋白序列，實現線粒體的靶向性，進而誘導ROS大量產生，探討其聯合電離輻射后對HeLa細胞的增殖抑制作用，為宮頸癌的放療增敏提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人宮頸癌HeLa細胞(本實驗室保存)，MEM完全培養基(Gibico公司，美國)，Hieff TransTM脂質體核酸轉染試劑(上海翊圣生物科技有限公司)，青霉素和鏈霉素(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，ROS測試盒(南京建成生物工程研究所)；CCK-8檢測試劑盒(MedChemExpress公司，美國)，Q5 PCR擴增試劑盒(NEB公司，美國)，引物和DNA連接酶(TaKaRa公司，大連)，細胞色素C氧化酶Ⅳ(COX Ⅳ)兔多克隆一抗和抗兔二抗(綠色熒光)(Santa Cruz公司，美國)，其他試劑均為國產分析純。細胞成像微孔板檢測儀Cytation3(Biotek公司，美國)，X射線輻照儀X-RAD 320iX(Precision X-ray Inc 公司，美國)。

1.2 質粒構建在GenBank中查閱小鼠Sarm1基因的線粒體定位序列并設計引物，同時設計KR和mCherry引物(下劃線部分為酶切位點)，因KR蛋白光照后失去活性，不適用于熒光觀察，因此以mCherry紅色熒光代替KR進行線粒體靶向鑒定。Sarm1引物：F (NotⅠ) 5′-AAGGAAAAAAGCGG-CCGCAATGGTCCTGACGCTG-3′，R (EcoR Ⅰ) 5′-CGGAATTCCCGATCGGCGCCCGGCCGTG-3′；mCherry引物：F (EcoRⅠ) 5′-GGAATTC-GCCACCATGGTGAGCAAGGG，R(BamHⅠ)5′-CGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-TG-3′；KR引物：F(EcoRⅠ) 5′-GGAATTCATGGGTTCAGAGGGC-3′，R (BamHⅠ) 5′-CGGGATCCCTAGATCTCGTCG-3′。分別以pGw1-myc-Sarm1質粒、plxsp-TetA-mCherry和plxsp-TetA-KR質粒為模板PCR擴增Sarm1、mCherry和KR片段，plxsp-flag空載體行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，將mCherry插入后構建plxsp-flag-mCherry載體,測序鑒定正確后，再進行NotⅠ和EcoRⅠ雙酶切，將Sarm1序列插入后構建plxsp-flag-sarm1-mCherry，測序鑒定正確后進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，將KR序列插入后構建plxsp-flag-Sarm1-KR載體，測序進行鑒定。

1.3 實驗分組HeLa細胞分為對照組、plxsp-flag組、plxsp-flag-Sarm1-KR組、4 Gy組、plxsp-flag+4 Gy組和plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy組。無菌條件下避光采用可見光源照射細胞，時間為10、30和60 min；X射線照射條件：電壓 180 kV，電流12.0 mA，靶皮距70 cm，劑量率 1.0 Gy·min-1，單次照射劑量為4 Gy。

1.4 融合蛋白線粒體靶向性鑒定因KR蛋白光照后即喪失活性，產生ROS，不適于進行熒光顯微鏡觀察，以與其氨基酸序列基本一致的紅色熒光蛋白mCherry進行線粒體靶向性鑒定。將HeLa細胞按照每孔2×105個細胞接種于鋪有蓋玻片的6孔板中，待細胞80%融合后將plxsp-flag-Sarm1-mCherry質粒轉染HeLa細胞，36 h后取出載玻片進行免疫熒光染色，以COX Ⅳ一抗作為線粒體定位標記(mito-track)，熒光顯微鏡照相并進行分析。

1.5 ROS生成水平檢測HeLa細胞達到80%融合后，0.25%胰酶消化，加入含有10% FBS無抗生素的MEM稀釋，按照每孔0.8×104個細胞接種到96孔板中，每孔加入質粒0.2 μg、轉染試劑0.2 μL，轉染結束后用錫紙包裹96孔板，避光在37℃、5% CO2條件下培養24 h，轉染結束后加入完全培養基100 μL，進行可見光照射，分別于照射后10、30和60 min加入DCFH-DA探針標記，并上機檢測，以平均熒光強度(mean fluoresencence intensity，MFI) 表示ROS生成水平，實驗設6復孔。

1.6 酶標儀檢測細胞增殖活性按照每孔0.8×104個細胞接種于96孔板，避光培養于培養箱內，質粒轉染后24 h進行可見光照射，12 h后進行4 Gy X射線照射，計為0 h，分別于4、10、24和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，繼續培養1.5 h，輕輕震蕩后采用酶標儀在450 nm 處檢測各孔吸光度[A(450)]值，以A值表示各組細胞增殖活性，實驗設6復孔。

2 結 果

2.1 plxsp-flag-KR載體構建PCR擴增獲得mCherry、KR和Sarm1產物，長度分別為729、735和108 bp(圖1)，經過酶切、DNA連接、產物轉化、單克隆挑取、質粒小提和測序(美國Macrogen公司)后，將測序結果與GenBank中序列進行比對，序列完全一致，表明成功構建plxsp-flag-Sarm1-mCherry和plxsp-flag-Sarm1-KR質粒。構建過程見圖2。

Lane 1， 6: 100 bp DNA marker; Lane 2,3: mCherry PCR products; Lane 4,5: KR PCR product; Lane 7,8: Sarm1 PCR product.

圖1 mCherry、KR和Sarm1 PCR擴增產物電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of PCR products of mCherry, KR and Sarm1

2.2 融合載體線粒體靶向性鑒定 構建的plxsp-flag-Sarm1-mCherry載體轉染HeLa細胞后，在細胞核(DAPI染藍色)外線粒體部位可見COX Ⅳ蛋白表達(綠色熒光)，而在相同位置可見mCherry蛋白表達(紅色熒光)，說明構建的載體能夠成功定位于線粒體。見圖3(插頁一)。

圖2 plxsp-flag-Sarm1-mCherry 和plxsp-flag-Sarm1-KR質粒構建示意圖

Fig.2 Diagram of construction plxsp-flag-Sarm1-mCherry and plxsp-flag-Sarm1-KR

2.3 可見光照射后各組細胞MFIs 質粒轉染后避光培養24 h，對照組和plxsp-flag組可見光照射10、30和60 min后摻入探針，探針摻入10、30和60 min后細胞MFI無明顯變化(P>0.05)。可見光照射10和30 min后摻入探針，plxsp-flag-Sarm1-KR組細胞MFI呈時間依賴性增加；與對照組比較，摻入探針60 min后plxsp-flag-Sarm1-KR組細胞MFI明顯增加(P<0.05)；可見光照射60 min后摻入探針，與對照組比較，摻入探針30和60 min后plxsp-flag-Sarm1-KR組細胞MFI明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 可見光照射10、30和60 min后各組 HeLa細胞MFI

GroupsProbe incorporation(t/min)MFIVisble right exposure(t/min) 103060Control10862.9±153.8841.8±131.71 062.5±99.630810.3±184.2985.5±10.21 031.9±143.560892.2±87.7983.7±31.8685.8±148.9Plxsp-flag10891.8±146.1874.0±164.91 001.8±179.930804.5±430.31 020.3±13.31 068.0±56.060807.2±58.4985.9±23.1703.2±170.6Plxsp-flag-Sarm1-KR10496.3±235.0975.4±33.5?785.8±156.4301 007.9±197.81 383.8±197.8971.2±107.7?601 354.3±276.2?1 058.3±27.5574.4±36.1?

*P<0.05vscontrol group.

2.4 各組細胞增殖活性 可見光照射30 min，12 h后行4 Gy X射線照射，與對照組比較，plxsp-flag組細胞增殖活性無明顯變化(P>0.05)； plxsp-flag-Sarm1-KR組細胞增殖活性在10和24 h時明顯降低(P<0.05)，4 Gy和plxsp-flag+4 Gy組細胞增殖活性在10 h時明顯降低(P<0.01)，plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy組細胞增殖活性在10、24和48 h時明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與plxsp-flag-Sarm1-KR組和4 Gy組比較， plxsp-flag-Sarm1-KR +4 Gy組細胞增殖活性均明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 4 Gy X射線照射后4、10、24和48 h各組細胞增殖活性

GroupProliferation activity (t/h) 4 10 24 48 Control1.000±0.1401.158±0.2011.468±0.0381.550±0.086Plxsp-flag1.027±0.0641.014±0.0901.461±0.1921.560±0.247Plxsp-flag-Sarm1-KR0.706±0.1110.982±0.053?1.341±0.147?1.491±0.2694 Gy0.989±0.0570.926±0.201??1.263±0.1411.257±0.060Plxsp-flag+4 Gy0.843±0.0950.818±0.093??1.143±0.1301.235±0.146Plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy0.867±0.1350.879±0.013?#0.942±0.054??△# 1.118±0.039??△#

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vsplxsp-flag-Sarm1-KR group；#P< 0.05vs4 Gy group.

3 討 論

目前，腫瘤常規的治療手段包含手術、放療和化療。放療是中晚期宮頸癌患者主要治療方法，但由于腫瘤對放療的抵抗和耐受的存在，其效果并不盡如人意。為緩解放療抵抗，提高放療效果，放療增敏劑應運而生，臨床醫生為增強放射線對腫瘤細胞的殺傷效應，常在放療時合并使用一些化學藥物或采用一些物理方法等，包括化學藥物、靶向基因或者傳統中藥等。基于ROS作用線粒體后可以誘導細胞發生凋亡、自噬和線粒體DNA損傷，外源性ROS也可以作為放療增敏劑，通過一定的策略增加其產量，誘導腫瘤細胞凋亡，更有效地提高放療的療效[8-12]。誘導ROS產生也是腫瘤光動力治療(photodymamic therapy，PDT)的基本原理，即利用光敏劑在可見光的照射下，導致ROS的產生，繼而作用于細胞，產生細胞殺傷。因此，腫瘤的PDT與放療聯合應用將具有良好的前景。

ROS是一類化學性質活潑，具有較高氧化活性的分子或離子，過量的ROS會對蛋白質、核酸和脂質等生物大分子造成損傷，從而影響其正常生理生化功能。ROS作用于線粒體后，損害線粒體的完整性，誘使蛋白修飾，引起脂質過氧化和線粒體DNA(mtDNA)的損傷，可能導致膜去極化，電位耗散，引起細胞線粒體內細胞色素c(Cyt c)、凋亡誘導因子(AIF)和Smac等促凋亡蛋白釋放，誘導細胞凋亡[13]。同時，線粒體激酶Pink(PTEN-induced putative kinase)將帕金蛋白(parkin)募集到線粒體外膜上，啟動線粒體自噬，引發選擇性自噬途徑[14-15]。這是ROS誘導細胞死亡的重要機制。

紅色熒光蛋白KR以二聚體形式存在，最大激發/發射波長為585/610 nm，既可以直接在靶細胞內單獨表達，也可以與靶蛋白融合表達，其蛋白中存在一個長的水通道結構，在540 ～ 580 nm的光照時可以產生致細胞損傷的ROS，一般為超氧陰離子和過氧化氫(H2O2)，同時蛋白失去活性[7, 16]。利用紅色熒光蛋白KR進行相關ROS誘導的研究中，主要利用其在激光照射下可以產生1 000倍于GFP照射產生的ROS，具有“爆發式”特點，使其發揮足量的作用。Sun等[17]用KR成功地靶向定標制造基因損傷(DART系統)，這種在特定基因位點引入損傷的系統，近年來為相關領域發展起到了助推作用。基于此理論，本文作者設想將線粒體靶向蛋白Sarm1序列克隆到KR蛋白序列的前面，構建融合蛋白表達載體，結果顯示：構建的融合表達載體具有線粒體靶向特性。本研究同時顯示：利用可見光照射可以誘導HeLa細胞內ROS產生，在可見光照射30 min后為ROS產生提供比較理想的條件。

本研究在上述誘導ROS產生的基礎上，進一步給予4 Gy X射線照射，觀察其對細胞增殖的影響，結果顯示：轉染了plxsp-flag-Sarm1-KR質粒的HeLa細胞在可見光照射后細胞增殖活性較對照組明顯降低，各組細胞經4 Gy X射線照射后增殖活性也明顯降低，且plxsp-flag-Sarm1-KR + 4 Gy組較plxsp-flag-Sarm1-KR組和4 Gy組細胞增殖活性進一步降低，說明可見光誘導ROS導致了細胞死亡，細胞增殖活性降低，且增強輻射誘導的細胞增殖抑制作用。本研究基于Sarm1線粒體靶向信號序列能夠實現線粒體基質靶向，而KR蛋白在光照下能夠失活，且誘導ROS“爆發式”產生，ROS的質和量都得到了保障[18]。因此，將融合表達質粒轉染腫瘤細胞，使線粒體靶向的融合蛋白既能實現線粒體靶向，又能光照后產生大量ROS，使得腫瘤細胞在進行放療前部分細胞死亡，再進行放射治療，增進放療對腫瘤細胞的殺傷效果。