基于網絡藥理學探討葛根治療高脂蛋白血癥的潛在作用靶點

治丁銘，隋殿軍，豈 蕊，苗永迪，韓 冬，婁石磊，邱 悅，孫 聰

(1.長春中醫藥大學針灸推拿學院針灸基礎教研室，吉林 長春 130117；2.長春中醫藥大學藥學院臨床藥學與中藥藥理教研室，吉林 長春 130117；3.長春中醫藥大學基礎醫學院生物化學教研室，吉林 長春 130117)

葛根(pueraria)是豆科植物野葛或粉葛的干燥根，始載于《神農本草經》，產地主要分布在吉林、遼寧、河北和河南等地，屬于吉林省道地藥材。葛根性涼，味甘、辛，具有解表退熱、生津、透疹、升陽止瀉等功效[1]。葛根中主要活性物質是異黃酮，如葛根素、3-羥基葛根素、3-甲氧基葛根素和葛根素-木糖苷等，其次是大豆苷、大豆苷元和花生素等，其中葛根素占主體[2]，還含有蛋白質、氨基酸、糖和鐵、鈣、銅、硒等礦物質[3]，是名貴滋補品，有“千年人參”之美譽。葛根素具有擴張冠狀動脈、抗心律失常、抗心肌缺血、抗脂質過氧化、抗血小板聚集和降血壓等心血管藥理作用，主要用于心腦血管疾病的治療[4]；還具有降血糖、降血脂、抗氧自由基和解痙等功能，但其具體作用機制尚不完全清楚。

隨著基因、蛋白和代謝組學的發展，許多學者嘗試用現代醫學解釋中藥的作用機制。但由于中藥多成分、多途徑和多靶點的特點，很難明確藥效物質基礎。基于數據庫的共享和系統生物學的理論，Hopkins[5]提出了網絡藥理學(network pharmacology)概念和研究方法，通過搜集數據庫的信息，構建系統網絡預測多分子協同作用機制。陶靈佳等[6]從TCM-PTD獲取健脾補腎復方中藥的分子、靶標，建立中藥分子-靶標互作網絡，篩選出378個中藥分子和63個大腸癌靶標，其相互作用共125組。李剛等[7]通過網絡拓撲分析淫羊藿，篩選出221個關鍵基因及淫羊藿治療骨質疏松癥Wnt、TGF-β和Notch等信號通路。本文作者采用網絡藥理學構建“藥物-靶點-疾病”的復雜網絡關系，預測葛根抗高脂蛋白血癥(hyperlipoproteinemia)的活性成分和潛在作用靶點，探討其抗高脂蛋白血癥的作用機制，為后續實驗研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 葛根潛在作用靶標的預測

1.1.1 葛根小分子化合物信息 采用臺灣中醫藥資料庫[8](TCM Database@Taiwan)、PubMed、SinoMed和化學數據庫等收集葛根的化學成分，得到22個已知化學成分信息。

1.1.2 葛根相似藥物和潛在作用靶標 采用Drugbank數據庫預測葛根中化學成分的相似藥物。Drugbank數據庫中包括詳細的藥物數據(如化學數據、藥理數據、藥物數據)和綜合的藥物靶點信息(如序列、結構和作用途徑)[9]。基于結構相似性原理，利用Drugbank中的similarity工具，獲得與葛根所含化學成分具有相似化學結構的已知藥物分子(結構相似度標準：similar score≥0.7)，并將已知相似藥物做為葛根藥物的候選靶標分子通過Mechanism afaction尋找其作用靶標。

1.2 高脂蛋白血癥相關基因

基于TTD(Therapeutic Target Database)、DrugBank、GAD(Genetic Association Database)和OMIM數據庫[10-11]，以“hyperlipoproteinemia”為關鍵詞進行檢索，獲取、篩選整理與高脂蛋白血癥相關的蛋白。

1.3 網絡構建與分析

基于蛋白質與蛋白質、化合物與蛋白質之間互作關系信息，采用HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT、STITCH、DIP、PDZBase、BIND和STRING數據庫，檢索選擇置信度高的分子(置信度標準：confidence≥0.7，high confidence)進行整合建立互作網絡。采用Cystoscape 3.6.0軟件[12]進行網絡構建、分析和可視化工作，“節點”代表分子如化合物、蛋白質和疾病，“邊”代表分子間相互作用關系如葛根活性成分與靶點、靶點與疾病、葛根活性成分、靶點與疾病的交互。通過評價網絡的拓撲結構特性來分析，構建葛根活性成分-靶標-疾病的相互作用網絡，通過分析葛根活性成分與靶點、靶點與疾病之間的復雜關系，預測藥物治療高脂蛋白血癥潛在的靶點及作用機制。

2 結 果

2.1 葛根潛在作用靶標

獲得51個與葛根中9種化學成分具有相似化學結構的已知藥物分子，見表1。刪除重復者后得到葛根中7種化學成分可能的60個蛋白靶標(其中2種成分Formononetin和Genistein-8-c-glucoside的相似藥物未找到靶標蛋白)。見表2。

表1 與葛根化學成分相似化學結構的藥物分子

表2 葛根化學成分作用靶點

2.2 靶點-疾病網絡藥理學

將各數據庫檢索結果進行篩選整理，獲得與高脂蛋白血癥疾病相關的28個蛋白，包括載脂蛋白E(APOE)、三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白A1(ABCA1)、載脂蛋白AⅠ(APOAⅠ)、載脂蛋白AⅡ(APOAⅡ)、載脂蛋白AⅤ(APOAⅤ)、載脂蛋白B(APOB)、載脂蛋白CⅠ(APOCⅠ)、載脂蛋白CⅡ(APOCⅡ)、雄激素受體(AR)、肉毒堿棕櫚酰基轉移酶2(CPT2)、細胞色素P450(CYP450)、胞漿環氧化物水解酶抗體(EPHX2)、科凱恩綜合征相關蛋白/早衰蛋白CSA抗體(ERCC8)、凝血因子Ⅺ(FACTOR Ⅺ)、纖維蛋白原A(FGA)、生長激素受體(GHR)、糖基磷脂酰肌醇高密度脂蛋白結合蛋白1(GPIHBP1)、G底物(GSBS)、中間α-球蛋白抑制因子H4(ITIH4)、低密度脂蛋白受體(LDLR)、谷胱甘肽磷酸膽固醇-高密度脂蛋白結合蛋白1(LIPI)、脂肪酶成熟因子1(LMF1)、核纖層蛋白(LMNA)、溶血磷脂酸(LPA)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARA)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)和RP1基因(RP1)。

通過軟件String 10.0和Cytoscape 3.6.0，用預測得到的藥物成分對應的60個靶點蛋白和28個疾病相關蛋白構建“靶點-疾病”相互作用網絡圖，見圖1。分析網絡拓撲結構顯示：此網絡包括54個節點和157條邊，其中54個節點包括22個疾病蛋白和32個靶點(其中包括3個共有成分)，每條邊表示疾病蛋白和靶點之間的相互關系，平均節點的degree值為4.76，聚集系數為0.451。Degree值超過平均值的靶標蛋白：Src、NF-κB、PPARs、雌激素受體α(Esr1)、AHR、APOAⅠ、APOAⅡ、APOAⅤ、APOB、APOCⅠ、APOCⅡ、APOE、LDLR、LPL、ABCA1、LPA、GPIHBP1和FGA，Cyp158A2和AR既是疾病相關蛋白又是藥物活性成分的靶點。預測這些蛋白可能是葛根治療高脂蛋白血癥的潛在靶點。

2.3 葛根活性成分-靶點-疾病網絡藥理學

將葛根活性成分-靶點的對應關系輸入到Cytoscape3.6.0軟件，得到的網絡與疾病蛋白-靶點網絡圖合并，直觀得到葛根中活性成分治療高脂蛋白血癥的潛在靶點，見圖2(插頁一)。圖中長方形代表葛根中的7個化學成分，三角形代表疾病的蛋白，橢圓形代表葛根化學成分的靶點。

2.4 KEGG通路富集分析

通過String10.0軟件，對靶點-疾病網絡中涉及的蛋白在信號通路中的作用進行KEGG pathway富集分析，得到12條信號通路，根據P<0.01篩選出8條，其中KEGG pathway通過查看基因在通路中的分布情況，可以了解該基因在代謝、信號轉導等通路中的作用。見表3。

表3 與高脂蛋白血癥相關的葛根潛在靶點富集的通路

3 討 論

本研究采用網絡藥理學篩選出葛根治療高脂蛋白血癥的7種活性成分。通過活性成分-靶點-疾病網絡特征分析，得到20個潛在治療靶點。PPAR可通過調節脂質代謝、抑制炎癥發揮作用。Esr1具有抗炎、促血管損傷修復、增加冠狀血流量的作用。NF-κB參與急慢性炎癥反應。CYP450是可自身氧化的亞鐵血紅素蛋白家族，屬于單氧酶；哺乳動物的CYP450是膜的組分，參與生物合成和許多生理活性物質的代謝。AR是核受體超家族中的類固醇受體，影響脂肪細胞分化、促進脂解作用和抑制脂質合成，減少脂肪在脂肪組織中的沉積，改善肝臟代謝，對心血管系統具有保護作用。APOAⅠ在膽固醇逆向轉運、抑制LDL的氧化修飾、保護血管內皮細胞及穩定細胞膜結構方面發揮重要作用。APOAⅡ與APOAⅠ一樣，具有抗動脈粥樣硬化的作用。APOAⅤ是甘油三酯代謝的關鍵酶LPL的激活劑，促進甘油三酯分解。APOB介導LDL與相應受體結合，調節LDL從血漿中清除。APOCⅠ抑制LPL活性，通過改變APOE結構使富含甘油三酯的脂蛋白延時清除。APOCⅡ激活LPL活性，也會通過改變LPL的空間結構激活LPL，催化水解甘油三酯。LPL是調節脂質代謝的關鍵酶，通過水解血漿中富含甘油三酯的脂蛋白為機體組織提供游離脂肪酸氧化供能。LPA是細胞膜脂類衍生物，有可能作為分子標記物，反映血小板等細胞的活化狀態，預警血栓形成的危險性。GPIHBP1在富含甘油三酯脂解過程中發揮重要作用，協助LPL轉運。ABCA1是細胞膜上重要的膽固醇流出調節蛋白，將細胞內的膽固醇轉運到細胞外，再經HDL運送到肝臟轉化為膽汁酸完成膽固醇代謝。FGA既是炎癥標志物又是凝血因子，FGA水平增高是動脈硬化的獨立危險因素。

圖1 高脂蛋白血癥相關蛋白-葛根化學成分潛在靶點網絡

Fig.1 Network of hyperlipoproteinemia-related proteins-potential targets of chemical constiuents of pueraria

綜合分析顯示：葛根中的黃豆苷、葛根素通過EP300與PPARs發生相互作用，PPARs在人和嚙齒類動物中包含PPARα、β和γ 3種亞型，PPARα主要在肝臟表達，可調控多種靶基因的表達，參與脂代謝所有過程如脂肪酸攝取、結合與氧化，脂蛋白組合、運輸與代謝的基因，是脂代謝關鍵的調節因子，促進過氧化物酶體和線粒體的脂肪酸β-氧化，加速脂肪酸的分解，促進膽汁酸的生成，對清除血中的膽固醇起著重要作用。體內合成的膽固醇和從血漿脂蛋白中吸收的膽固醇均需轉化成膽汁酸或以游離膽固醇形式經肝膽管排出，CYP7A1是膽固醇轉化為膽汁酸的限速酶[13-14]，在膽固醇的代謝中起重要作用，CYP7A1表達依賴PPARα。而CYP7A1是CYP450家族中的成員，除了在骨骼肌和成熟的紅細胞外所有的組織和器官均表達。研究[15-16]顯示：PPARα激活劑GW7845和PPARγ配體WY14643、羅格列酮可提高巨噬細胞ABCA1 mRNA水平，促進細胞內膽固醇流出。PPARγ影響GPIHBP1的表達，在GPIHBP1的調控序列上發現許多PPARs的結合位點，其中5個是結合PPARγ的。GPIHBP1通過與乳糜微粒上帶有正電荷的載脂蛋白A5、E、B48結合，同時與LPL結合發揮脂解平臺的作用。

葛根中花生四烯酸(arachidonic acid)是生物體內含量豐富、分布廣泛的多不飽和脂肪酸，可經CYP450氧化酶途徑代謝為環氧化二十碳三烯酸(EETs)，降解為活性較弱的二羥基-20碳三烯酸[17]。CYP450-EETs系統在調節機體脂代謝方面發揮重要作用，過表達可減輕高脂飲食誘導的肥胖小鼠皮下及內臟脂肪的積聚，減輕肥胖小鼠體質量，改善高脂誘導的血管功能異常[18]；可通過抑制脂毒性相關的炎性反應和氧化應激從而減輕高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝小鼠的肝臟脂肪變性[19]。研究[15]顯示：CYP和EETs均是PPARα的配體激動劑。葛根中的甾醇類藥物是γ-谷甾醇，預測發現其相似藥物的靶標分子是通過AR和Esr1發揮作用的，睪酮有改善脂質代謝的作用，雌激素能提高肝臟中ABCA1的表達水平。Nettleship等[20]觀察睪酮及AR功能缺失的睪丸雌性化的小鼠發現：睪酮水平與HDL呈正相關關系；Haffner等[21]的流行病學調查發現：睪酮與脂質代謝有關，睪酮水平與總膽固醇、LDL及甘油三酯呈負相關關系；Malkin等[22]對性功能減退男性采用睪酮替代治療可改善血脂代謝，降低總膽固醇，降低炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素1和6(IL-1和IL-6)的表達，提高IL-10表達；睪酮的調脂機制可能是通過激活肝臟的LPL，使游離脂肪酸向外周組織轉運，促進其進入三羧酸循環氧化分解。Esr1與雌激素結合，調節血管平滑肌細胞和內皮細胞的功能，影響血管的收縮和舒張；還可通過改善脂代謝，降低總膽固醇和LDL，增加HDL水平，Esr1具有抗炎、促血管損傷修復、增加冠脈血流量等多重作用[23]。

綜上所述，本文作者推測葛根的有效成分通過上述靶點相互作用，實現其降脂、抗炎和改善血管彈性等作用。本研究結果為后續的實驗研究提供了科學依據。