雙酚A聯合己烯雌酚對未成年雌性SD大鼠的雌激素效應

王 娟，劉文龍，趙 苒，范 春

(1. 廈門醫學院醫學技術系，福建 廈門 361023； 2. 福建省廈門市婦幼保健院兒童發育行為科，福建 廈門 361003；3. 廈門大學公共衛生學院 分子疫苗學和分子診斷學國家重點實驗室，福建 廈門 361102)

環境雌激素(environmental estrogens,EEs)是廣泛存在于自然界并能影響人類健康的一大類外源性化學物的總稱，主要來自塑料增塑劑、洗滌劑和阻燃劑等化學制品，按其化學結構差異分為雙酚類、烷基酚類和鄰苯二甲酸酯類等。雌激素樣污染物進入環境后，造成人群多途徑混合暴露，并在生態系統中通過食物鏈蓄積，最終損害人類健康[1-2]。由于環境污染的復雜性和多樣性，僅就單一物質評價EEs的危害效應是遠遠不夠的[3-4]。從人群實際暴露情況來看，聯合作用的研究對于深入了解EEs危害程度及危害機制均具有重要的現實意義，但目前相關報道較少。本研究擬選擇具有雌激素樣作用的雙酚A (bisphenol A，BPA) 和己烯雌酚 (diethylstilbestrol，DES) 作為受試物，采用子宮增重實驗評價BPA和DES的聯合雌激素效應，為深入探討EEs對機體健康影響的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 70只未成年雌性SD大鼠(21 d)，體質量30～40 g，購自四川抗生素工業研究所(合格證：川實動管質第15號)。按改良配方，飼以不含植物雌激素的飼料。整個實驗過程中，動物自由攝食和飲水，室溫20℃～23℃，相對濕度50%～70%，12 h/12 h明暗周期。動物按體質量采用區組隨機分組，根據預實驗結果，分為200、400和800 mg·kg-1BPA組，15和150 μg·kg-1DES組，BPA+DES聯合組(100 mg·kg-1BPA + 7.5μg·kg-1DES，200 mg·kg-1BPA + 7.5 μg·kg-1DES，400 mg·kg-1BPA + 7.5 μg·kg-1DES，400 mg·kg-1BPA + 75.0 μg·kg-1DES)，同時設花生油溶劑對照組，每組7只。

1.2 主要試劑 BPA購自上海試劑一廠，DES購自美國Sigma公司，以市售花生油作為溶劑。

1.3 染毒方法 各組大鼠根據分組情況，按1 mL·100 g-1灌胃給藥，每天1次，連續給藥3 d。給藥期間每天稱大鼠體質量，并按體質量調整給藥量，觀察陰道開口情況。于末次給藥后24 h股動脈放血處死動物，迅速剝離子宮，在電子天平上稱濕質量(結果以mg表示)，以15%甲醛固定。

1.4 取材制片 大鼠子宮固定3 d后，將子宮分為3段：輸卵管端、宮體端和陰道端，于同一水平面垂直石蠟包埋。連續切片，厚5 μm，共3片/側子宮角。染色后鏡檢。

1.5 染色方法 ① HE染色：按常規HE染色操作；②凡氏染色：采用苦味酸酸性復紅法進行平滑肌特殊染色。

1.6 各組大鼠子宮形態計量 ①宮腔上皮厚度：每組切片隨機選擇5個視野，200倍鏡下觀察，測量宮腔上皮高度，取平均值，結果以μm表示；②宮腔平滑肌厚度：每組切片隨機選擇5個視野，200倍鏡下觀察，測量宮腔平滑肌厚度，取平均值，結果以μm表示；③宮腔腺體數量：每組切片隨機選擇5個視野，計算5個視野的總面積，并統計其中的子宮腺體總數，計算單位面積下的子宮腺體數量，以個/μm2表示；④成熟卵泡數量：每組切片隨機選擇5個視野，計算5個視野的總面積，并統計其中的成熟卵泡總數，計算單位面積下的成熟卵泡數量，以個/μm2表示。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況和體質量變化 單獨或聯合給予DES和BPA染毒，大鼠均出現活動減少、精神萎靡和被毛蓬松無光澤等表現，各組大鼠體質量增加與對照組比較差異均無統計學意義 (P>0.05)，實驗過程中無大鼠死亡。見表1。

表1 各組大鼠體質量

GroupBody weight Before exposureAfter exposureIncreased weightControl32.07±5.6435.42±7.683.35±2.06BPA (mg·kg-1) 20034.27±7.8739.62±8.625.35±1.85 40034.66±7.9632.28±5.552.62±1.54 80035.87±7.0139.62±14.724.75±3.14DES (μg·kg-1) 1532.60±3.1836.38±7.963.78±1.01 15036.11±6.1339.83±10.503.72±1.40BPA(mg·kg-1) + DES (μg·kg-1) 100.0+7.533.82±5.6237.02±4.233.20±1.89 200.0+7.533.88±4.0436.90±4.863.02±1.62 400.0+7.532.10±4.7137.16±4.635.06±0.96 400.0+75.034.23±4.0739.58±5.755.35±4.33

2.2 各組大鼠子宮大體形態表現 與對照組比較， 800 mg·kg-1BPA組大鼠子宮濕質量和子宮/體質量比明顯增加(P<0.05)；與對照組比較，各劑量DES組大鼠子宮不僅明顯增大，而且出現水腫現象，隨著劑量的增加，各劑量DES組大鼠子宮濕質量和子宮/體質量比明顯增加(P<0.05)。同時給予BPA和DES染毒，與對照組比較，各劑量聯合組大鼠子宮明顯增大，子宮濕質量和子宮/體質量比明顯增加 (P<0.05)，但與各劑量DES組比較差異均無統計學意義 (P>0.05)。見表2和圖1(插頁一)。

2.3 各組大鼠子宮組織病理形態表現 與對照組比較， 800 mg·kg-1BPA組大鼠子宮腔上皮高度增加，但仍為單層立方狀上皮，宮腔平滑肌層變厚；各劑量DES組和各劑量聯合組大鼠子宮腔上皮高度明顯增加，表現為柱狀上皮，子宮腔擴張，固有層和肌層分層好，平滑肌層明顯增厚，平滑肌細胞特征明顯，腺體數量增加(圖2，見插頁一)。與對照組比較，800 mg·kg-1BPA組、各劑量DES組和各劑量聯合組大鼠宮腔上皮高度、平滑肌層厚度和宮腔腺體數量均明顯增加 (P<0.05)，但各劑量聯合組與各劑量DES組比較差異均無統計學意義 (P>0.05)。見表3。

表2 各組大鼠子宮濕質量和子宮/體質量比

GroupUterine weight (m/mg)Ratio of uterine weight to body weight (η/‰)Control23.55±9.460.66±0.20BPA (mg·kg-1) 20028.00±9.840.66±0.11 40034.40±6.880.92±0.10 80044.50±10.95?1.09±0.23?DES (μg·kg-1) 15128.60±32.99?3.59±0.88? 150134.33±41.85?2.99±1.22?BPA(mg·kg-1) + DES (μg·kg-1) 100.0+7.5141.60±32.39?3.80±0.57? 200.0+7.5147.80±17.41?4.05±0.60? 400.0+7.5124.60±21.66?3.42±0.89? 400.0+75.0138.17±42.62?3.58±1.33?

*P<0.05 compared with control group.

2.4 各組大鼠卵巢發育情況 與對照組比較，各劑量BPA組大鼠成熟卵泡數量差異均無統計學意義 (P>0.05)，800 mg·kg-1BPA組大鼠宮腔腺體數量增加(P<0.05)，各劑量 DES組大鼠宮腔腺體數量和成熟卵泡數量均明顯增加(P<0.05)。與對照組比較，同時給予BPA和DES后，各聯合組大鼠宮腔腺體數量和成熟卵泡數量明顯增加(P<0.05)，但與各劑量DES組比較差異均無統計學意義 (P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠宮腔上皮高度、平滑肌厚度、宮腔腺體數量和成熟卵泡數量

GroupHeight of luminal epithelium(l/μm)Thickness of myometrium(l/μm)Amount of uterine glands(μm-2)Amount of mature follicle(μm-2) Control11.76±3.0849.87±6.121.33±0.581.33±0.58BPA (mg·kg-1) 20014.40±4.2155.39±14.881.00±0.521.33±1.16 40014.86±2.2158.52±2.491.33±0.531.67±0.58 80021.33±3.56?85.78±10.41?3.33±0.58?2.67±0.58DES (μg·kg-1) 1564.93±5.41?168.63±11.73?6.00±1.73?4.67±0.58? 15064.71±12.88?172.19±19.79?5.67±1.53?4.33±2.08?BPA(mg·kg-1) + DES (μg·kg-1) 100.0+7.569.45±6.06?175.42±22.88?5.33±3.51?5.33±3.22? 200.0+7.571.23±12.01?164.77±7.73?5.67±1.53?6.33±1.53? 400.0+7.565.07±4.57?166.41±12.08?5.67±1.00?5.67±2.31? 400.0+75.064.76±5.54?161.23±13.93?5.00±1.00?5.33±1.16?

*P<0.05 compared with control group.

2.5 各組大鼠陰道開口情況 單獨或聯合給予BPA和DES，各組大鼠陰道開口率均為0，說明實驗過程中所有受試物均未使大鼠陰道開口提前，即所有受試物均未明顯促進陰道的發育。

3 討 論

子宮增重實驗是篩檢雌激素活性化合物體內試驗的“金標準”。子宮含有豐富的雌激素受體，在未成年雌性大鼠子宮生長靜止期(postnatal day,PND 17～26 d)給予受試物即可以檢測出雌激素樣物質[5-6]。傳統的子宮增重實驗采用子宮濕(干)質量和子宮臟器系數作為檢測終點。隨著該方法的應用增多，人們發現雌激素除了能引起子宮質量增加外，還可以引起子宮組織和細胞水平的改變，故可通過測定宮腔上皮高度、宮腔平滑肌厚度和宮腔腺體數量等來評價外來化合物的雌激素樣作用。本研究結果顯示：單獨給予800 mg·kg-1BPA后，未成年雌性SD大鼠子宮增大，宮腔上皮高度和宮腔平滑肌厚度增加，宮腔腺體數量增加；單獨給予DES染毒后，各劑量DES組大鼠子宮反應更為強烈，即使在15 μg·kg-1劑量組中，大鼠宮腔上皮也明顯增高，上皮細胞從單層立方狀變為柱狀，平滑肌層厚度增加，出現了明顯的平滑肌細胞特征，表明BPA和DES在本實驗中均表現出了雌激素樣作用，DES的雌激素活性遠遠大于BPA，至少為BPA雌激素活性的10 000倍，與國內外文獻報道[7-8]一致。

隨著EEs研究的逐漸深入，研究者發現某些物質在單獨作用時雌激素活性很弱，但混合后卻出現協同作用，尤其是“Something from Nothing”現象的出現引起了研究者對EEs 聯合毒性作用的關注[2,9]。EEs種類繁多，造成人類處于混合暴露狀態，由于聯合作用機制尚不清楚，且研究結論[10-12]并不一致，因此加強EEs聯合作用的研究十分必要。BPA是工業制造中一類重要的增塑劑，DES則是一種人工合成非甾體類雌激素，均可通過雌激素受體產生雌激素活性[13-14]。考慮到二者具有相似的作用機制，有學者[15-16]研究了低劑量BPA和DES的聯合暴露效應，結果顯示:BPA和DES的聯合暴露對雄性大鼠睪丸及附睪有明顯毒害作用，對大鼠精子活動能力及激素水平也有明顯的影響，呈現出聯合效應。為了進一步深入探討BPA和DES的聯合作用，本研究采用子宮增重實驗對BPA和DES的聯合雌激素效應進行了評價，結果顯示：各劑量聯合組大鼠子宮濕質量、子宮/體質量比、子宮腔內膜上皮高度和平滑肌厚度與單獨應用DES組比較差異無統計學意義，說明在本實驗條件下BPA和DES聯合后并未出現協同或拮抗效應，僅為簡單的相加作用。如果2種毒物作用機制相同，聯合后常表現為協同作用；若作用機制不同，其聯合作用常表現為相加作用。BPA和DES可通過相同途徑產生作用，其相加作用可能由于DES在單獨作用時已表現出很強的雌激素活性，子宮均出現水腫現象，即DES在15 μg·kg-1劑量時其活性已達到最大值，活性不會再隨著劑量的增加而增大，甚至達到某一劑量時反而出現抑制，故可能DES完全掩蓋BPA的效應，聯合后表現為相加作用。

由于EEs作用途徑眾多，作用機制復雜，要了解環境化合物的雌激素效應及其與疾病發生的關系，應結合更多的體內外實驗研究和流行病學調查資料才能作出正確評價。