痛風(fēng)寧膠囊對(duì)痛風(fēng)性腎病模型小鼠主要臟器病理?yè)p傷的改善作用

樊海瑞，趙 巖，傅警龍，張海波，王德超，郜玉鋼，張連學(xué)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院人參工程技術(shù)研究中心，吉林 長(zhǎng)春130118；2.吉林省長(zhǎng)春市長(zhǎng)中風(fēng)濕骨病醫(yī)院風(fēng)濕科，吉林 長(zhǎng)春130021)

痛風(fēng)是一組嘌呤代謝紊亂、血尿酸水平升高所致組織損傷的異質(zhì)性疾病，常累及腎臟，引起腎尿酸結(jié)石及腎間質(zhì)病變[1]。目前用于治療痛風(fēng)的藥物主要有秋水仙堿(colchicine)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β)抑制劑、非甾體抗炎藥(NSAIDs)、促腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)(ACTH)和皮質(zhì)類(lèi)固醇類(lèi)(corticosteroids)等[2]。此類(lèi)藥物雖作用迅速且效果明顯，但患者需長(zhǎng)期使用并常伴有嚴(yán)重的不良反應(yīng)。我國(guó)相關(guān)專(zhuān)業(yè)研究者[3-11]在建立痛風(fēng)動(dòng)物模型和觀察藥物療效等領(lǐng)域進(jìn)行了大量考察，證實(shí)有些中藥具有治療痛風(fēng)及其并發(fā)癥的效果。

痛風(fēng)寧膠囊(TFN，長(zhǎng)春醫(yī)藥大學(xué)風(fēng)濕骨病醫(yī)院提供)組方由土茯苓、澤蘭、蠶砂、黃柏、大黃和金錢(qián)草等21味中藥組成，是長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)風(fēng)濕骨病醫(yī)院臨床多年應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)方，在臨床上已使用十余年，對(duì)痛風(fēng)具有良好的治療效果[12-13]。本文作者主要研究不同劑量TFN對(duì)腺嘌呤聯(lián)合乙胺丁醇片所致痛風(fēng)性腎病模型小鼠主要臟器病理?yè)p傷的改善作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用TFN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器 70只雄性KM小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自長(zhǎng)春市生物制品研究所有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(吉)2011-0003。TFN膠囊(規(guī)格：0.5 g，批準(zhǔn)文號(hào)：吉藥制字Z2007A050)，長(zhǎng)春市長(zhǎng)中風(fēng)濕骨病醫(yī)院提供；痛風(fēng)舒片(TFS)(規(guī)格：0.3 g，生產(chǎn)批號(hào)：20141201)，山西仁源堂藥業(yè)有限公司；別嘌醇片(規(guī)格：0.1 g，生產(chǎn)批號(hào)：20150422)，世貿(mào)天階制藥(江蘇)有限責(zé)任公司；腺嘌呤(貨號(hào)：A8626-100G)，美國(guó)Sigma公司；鹽酸乙胺丁醇片(規(guī)格：0.25g，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H21022349)，沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司。尿酸(UA)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN) 、黃嘌呤氧化酶(XOD) 、單核趨化蛋白(MCP-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和環(huán)氧化酶(COX-2)試劑盒均購(gòu)自長(zhǎng)春百金生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。酶標(biāo)儀(SPECTRAMAX190)，美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.2 動(dòng)物模型的制備和分組[14- 15]70只健康小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為7組：對(duì)照組，模型組，別嘌醇片和TFS陽(yáng)性藥對(duì)照組，低、中和高劑量TFN組，每組10只。除對(duì)照組之外，其他各組小鼠均以腺嘌呤(100 mg·kg-1)和鹽酸乙胺丁醇片(250 mg·kg-1)灌胃給藥進(jìn)行造模，每天1次。第8天模型制備成功后，各組小鼠開(kāi)始灌胃給藥，共給藥14 d。根據(jù)人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥量的劑量換算[16]，低、中和高劑量TFN組TFN劑量分別為200、400和800 mg·kg-1，別嘌醇片劑量為50 mg·kg-1，TFS劑量為600 mg·kg-1;對(duì)照組和模型組小鼠均灌胃給予等量生理鹽水。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)和方法[17]實(shí)驗(yàn)第22 天 給藥1 h后，小鼠摘眼球取血，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)采用酶聯(lián)反應(yīng)法測(cè)定血清中UA、Cr、BUN、MCP-1、TNF-α和XOD水平。取小鼠腎臟迅速與生理鹽水1∶9混合，勻漿，勻漿液取上清檢測(cè)小鼠腎組織中COX-2活性。

1.4 HE染色觀察小鼠腎臟、胸腺和脾臟組織病理形態(tài)表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)第22天給藥1 h后，小鼠脫頸椎處死，取其腎臟、胸腺和脾臟組織，用預(yù)冷生理鹽水進(jìn)行清洗并稱(chēng)質(zhì)量，10%甲醛溶液固定24 h，脫水石蠟包埋，切片，置于干凈載玻片后，HE染色，光鏡下觀察組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清中UA、Cr和XOD水平 與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中UA、Cr和XOD水平均明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，別嘌醇片和TFS陽(yáng)性藥對(duì)照組及高劑量TFN組小鼠血清中UA、Cr和XOD水平均明顯降低(P<0.01)，低和中劑量TFN組小鼠血清中UA、Cr和XOD水平有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清中UA、Cr和XOD水平

GroupDose(mg·kg-1)Cr[cB/(μmol·L-1)]XOD[ρB/(ng·L-1)]UA [ cB/ (μmol·L-1)]Control 055.53±11.4311.53±1.8961.13±7.17Model 0113.42±18.29?55.65±10.23?103.74±18.82?Allopurinol50 68.91±6.65△22.58±2.11△76.47±13.75△TFS600 67.43±9.54△23.81±1.38△77.47±8.01△TFN Low dose200 98.11±8.5351.46±3.8491.82±11.14 Medium dose400 94.91±15.1346.33±7.5989.95±6.74 High dose800 70.26±12.25△25.99±1.93△80.77±8.60△

*P<0.01vscontrol group；△P<0.01vsmodel group.

2.2 各組小鼠血清中MCP-1、TNF-α和BUN水平 與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中BUN、MCP-1和TNF-α水平均明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，別嘌呤醇和TFS陽(yáng)性藥對(duì)照組及高劑量TFN組小鼠血清中BUN、MCP-1和TNF-α水平均明顯降低(P<0.01)，低和中劑量TFN組小鼠血清中BUN、MCP-1和TNF-α水平有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清中MCP-1、TNF-α和BUN水平

GroupDose(mg·kg-1)MCP-1[ρB/(ng·L-1)]TNF-α[ρB/(ng·L-1)]BUN[cB/(pmol·L-1)]Control 0217.27±27.4261.42±16.05105.78±22.70Model 0300.75±28.74?125.04±14.27?194.26±19.75?Allopurinol50 237.58±19.38△75.43±4.76△124.26±11.97△TFS600 241.99±16.84△77.10±8.17△123.17±18.99△TFN Low dose200 284.72±19.07110.81±7.34181.83±23.83 Medium dose400 280.39±22.70109.33±11.81177.01±21.53 High dose800 251.55±27.45△86.71±6.49△134.78±13.57△

*P<0.01vscontrol group；△P<0.01vsmodel group.

2.3 各組小鼠腎組織勻漿上清液中COX-2活性 與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織勻漿上清液中COX-2活性明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，別嘌呤醇和TFS陽(yáng)性藥對(duì)照組及高劑量TFN組小鼠腎組織勻漿上清液中COX-2活性均明顯降低(P<0.01)，低和中劑量TFN組小鼠腎組織勻漿上清液中COX-2活性有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠腎組織勻漿上清液中COX-2活性

Tab.3 Activities of COX-2 in kidney tissue homogenate in mice in various groups

GroupDose(mg·kg-1)COX-2Control 042.01±3.99Model 092.10±18.77?Allopurinol50 54.79±8.61△TFS60055.32±10.89△TFN Low dose200 82.71±13.15 Medium dose400 78.51±10.28 High dose800 66.50±8.18△

*P<0.01vscontrol group；△P<0.01vsmodel group.

2.4 各組小鼠腎臟組織病理形態(tài)表現(xiàn) 對(duì)照組小鼠腎組織中腎小球、腎小管和腎間質(zhì)形態(tài)均正常。與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織中腎小球萎縮，腎小管水腫，腎小管和腎間質(zhì)出現(xiàn)大量尿酸鹽結(jié)晶。與模型組比較，別嘌呤醇和TFS陽(yáng)性藥對(duì)照組及高劑量TFN組小鼠腎臟組織病變明顯改善，腎小球與腎間質(zhì)可見(jiàn)少量的尿酸鹽結(jié)晶,低和中劑量TFN組小鼠腎臟組織病變無(wú)明顯改變(圖1，見(jiàn)插頁(yè)二)。

2.5 各組小鼠胸腺組織病理形態(tài)表現(xiàn) 對(duì)照組小鼠胸腺分葉清楚，胸腺皮質(zhì)細(xì)胞密集。與對(duì)照組比較，模型組小鼠胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)分界不清晰，細(xì)胞稀疏。與模型組比較，別嘌呤醇和TFS陽(yáng)性藥對(duì)照組及高劑量TFN組小鼠胸腺病理變化明顯改善，低和中劑量TFN組小鼠胸腺病理變化有一定程度改善，但表現(xiàn)不明顯(圖2，見(jiàn)插頁(yè)二)

2.6 各組小鼠脾臟組織病理形態(tài)表現(xiàn) 對(duì)照組小鼠脾臟中紅髓和白髓分界清晰，脾小結(jié)淋巴細(xì)胞密集，脾竇無(wú)充血現(xiàn)象。與對(duì)照組比較，模型組小鼠脾臟紅髓和白髓分界不清晰，脾小結(jié)不同程度縮小，脾竇出現(xiàn)充血現(xiàn)象。與模型組比較，別嘌呤醇和TFS陽(yáng)性藥對(duì)照組及高劑量TFN組小鼠脾臟病理變化明顯改善，脾臟紅髓和白髓分界較清晰，脾臟充血現(xiàn)象得到改善，低和中劑量TFN組小鼠脾臟病理變化有一定程度改善，但不明顯(圖3，見(jiàn)插頁(yè)二)。

3 討 論

治療痛風(fēng)的西藥有較多的不良反應(yīng)，如秋水仙堿具有惡心、腹瀉等不良反應(yīng)；非甾體抗炎藥會(huì)導(dǎo)致腎損傷、胃腸道潰瘍和出血等，IL-1β抑制劑有加重痛風(fēng)癥狀的危險(xiǎn)[18-19]。由于以上不良反應(yīng)，臨床上治療痛風(fēng)時(shí)會(huì)遇到對(duì)各種藥物使用的限制問(wèn)題。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療痛風(fēng)方面具有標(biāo)本兼治的特點(diǎn)，且中藥復(fù)方聯(lián)合用藥具有增效和減毒的優(yōu)勢(shì)[20-21]。

本研究結(jié)果顯示：TFN可以較好地緩解痛風(fēng)性腎病患者的各項(xiàng)病理變化，而且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中受試小鼠生長(zhǎng)正常，無(wú)腹瀉等不良反應(yīng)。本研究中，高劑量TFN組小鼠血清中UA、Cr、BUN、MCP-1、TNF-α和XOD等生化指標(biāo)水平明顯降低，腎組織中COX-2水平明顯降低；同時(shí)，高劑量TFN具有改善小鼠腎臟腎小球萎縮現(xiàn)象、清除腎小管與腎間質(zhì)尿酸鹽結(jié)晶和緩解胸腺及脾臟等臟器病理變化的效果，使脾臟脾竇充血現(xiàn)象得到緩解、胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)分界較清晰，而低和中低劑量TFN組小鼠上述病理改變不明顯。

研究[22-25]顯示：黃酮類(lèi)化合物如槲皮素、山奈酚、木犀草素和桑色素等對(duì)于治療痛風(fēng)發(fā)揮著重要作用。本課題組前期研究顯示：TFN組方中含有生物堿及黃酮類(lèi)等化合物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步利用該組方治療痛風(fēng)性腎病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。