人羊膜成纖維細(xì)胞的分離和鑒定

張嘯環(huán)，段明華，閆玉禮，潘 新，李海清，周長龍，趙天倚

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥炮制教研室，吉林 長春 130107；2.空軍航空大學(xué)，吉林 長春 130022)

人羊膜是一種胎膜，分為人羊膜上皮層細(xì)胞[1]和人羊膜間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞[2]，其中人羊膜成纖維細(xì)胞屬于間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的臨床醫(yī)學(xué)日益受到關(guān)注，所以如何選擇一種最適合臨床細(xì)胞治療的種子細(xì)胞，又不引起倫理爭議、不致癌且安全性高，是醫(yī)學(xué)工作者們努力的目標(biāo)。

陳旭東等[3]對(duì)人羊膜上皮細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞進(jìn)行了研究，誘導(dǎo)分化12 h后的細(xì)胞呈現(xiàn)雙極、多極和錐形的典型神經(jīng)元形態(tài)。研究[4-6]顯示：在人羊膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及肝細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)的研究中，人羊膜上皮細(xì)胞能表達(dá)肝細(xì)胞特異性蛋白，具有肝細(xì)胞的部分生物學(xué)特性。目前對(duì)人羊膜成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究較少，本實(shí)驗(yàn)分離人羊膜成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)和鑒別，旨在為人類胚胎干細(xì)胞性質(zhì)和細(xì)胞誘導(dǎo)分化研究奠定基礎(chǔ)，并為中藥作用于細(xì)胞以及細(xì)胞的病變研究提供體外細(xì)胞培養(yǎng)模型。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器DMEM和胎牛血清(美國Gibco公司)，表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、膠原酶、Triton X-100、DNase酶、鼠抗人波形蛋白(Vimentin)抗體和鼠抗人S100鈣結(jié)合蛋白A4(S100A4)抗體(美國Sigma公司)，胰蛋白酶(美國Amreseo公司)，鼠抗人角蛋白19(CK19)抗體和HRP/DAB檢測試劑盒 (美國Gene Tech公司)，F(xiàn)SP-FITC單抗(上海研晶商貿(mào)有限公司)。Nikon Eclipse TS100熒光倒置顯微成像系統(tǒng)(日本尼康儀器有限公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(蘇州江東精密儀器有限公司)，高壓滅菌鍋(北京北瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2 人羊膜成纖維細(xì)胞的獲得① 羊膜組織來源于健康、擇期剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的胎膜[7]。經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，用機(jī)械法剝?nèi)⊙蚰そM織12份，用D-Hank’s液沖洗，直至表面血跡沖洗干凈，剪碎后存放于4℃含40 mg·L-1EGF的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行原代細(xì)胞消化處理。②將組織塊放入50 mL含0.02%EDTA的0.1%的胰蛋白酶消化液中，37℃、100～150 r·min-1旋轉(zhuǎn)消化30 min；棄去消化液，重復(fù)消化1次。③胰蛋白酶消化結(jié)束后，使用PBS溶液清洗3次，再將組織塊放入50 mL 含0.005%DNase酶的0.25%膠原酶消化液中，消化50 min，直至組織塊完全消化為止[8]。④采用200目經(jīng)過滅菌的尼龍紗布過濾膠原酶細(xì)胞消化液，收集濾液于無菌50 mL離心管中，2 300 r·min-1離心10 min，棄去上清液，使用PBS溶液沖洗3次，終止膠原酶的消化，然后使用5 mL含40 mg·L-1EGF的 DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。⑤配制Percoll分離液，將5 mL細(xì)胞懸液緩慢添加到Percoll梯度液上層，2 500 r·min-1離心20 min；離心后Percoll溶液形成3個(gè)明顯的細(xì)胞帶，將中部形成的細(xì)胞條帶回收，使用培養(yǎng)液稀釋后2 300 r·min-1離心10 min，棄去上清液。⑥采用5 mL 含40 mg·L-1EGF的DMEM培養(yǎng)液[9]懸浮細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù),使得細(xì)胞密度為(2～3)×105mL-1。

1.3 人羊膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)在含40 mg·L-1EGF的DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清。將細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和稀釋，使細(xì)胞密度為3.0×105mL-1。采用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔放入蓋玻片，加入2.0 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，放置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞爬片。待細(xì)胞接近長滿后，取出細(xì)胞爬片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。

1.4 人羊膜成纖維細(xì)胞的鑒別①人羊膜成纖維細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)觀察：選取培養(yǎng)4、7和12 d的原代細(xì)胞。②人羊膜成纖維細(xì)胞HE染色：將取出的細(xì)胞爬片用PBS溶液沖洗3次。蘇木素染色、稀鹽酸乙醇分色、氨水返藍(lán)細(xì)胞核、伊紅染色、乙醇梯度脫水和二甲苯透明處理，固定于載玻片上，顯微鏡下觀察。③人羊膜成纖維細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒別：將取出的細(xì)胞爬片用PBS溶液洗滌3次，4%多 聚甲醛固定10 min。PBS溶液洗滌3次，用0.3%Triton- X100室溫下作用15～20 min，PBS溶液洗滌3次。3%H2O2室溫孵育15 min，用含1%BSA的PBS室溫下封閉30 min， PBS溶液洗滌3次，每次5 min。分別加入一抗(PBS、鼠抗人Vimentin抗體、S100A4抗體和CK19抗體)，37℃孵育30 min，PBS溶液洗滌3次，每次5 min。加入二抗，37℃孵育30 min，PBS溶液洗滌3次，每次5 min，DAB室溫顯色30 min。90%甘油封片，顯微鏡下觀察。④人羊膜成纖維細(xì)胞生長曲線：以第3代細(xì)胞為測試樣品，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105mL-1，接種于2個(gè)24孔培養(yǎng)板，每孔0.5 mL，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h換液1次。每天選取3個(gè)孔，用含 0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)10 d，繪制生長曲線。

1.5 人纖維母細(xì)胞表面抗原(FSP)-FITC單抗標(biāo)記法測定人羊膜成纖維細(xì)胞純度① 陰性對(duì)照細(xì)胞和人羊膜成纖維細(xì)胞樣品制備：人羊膜成纖維細(xì)胞表面特異性抗原為FSP，選擇的陰性對(duì)照細(xì)胞為小鼠肝臟原代細(xì)胞，其細(xì)胞表面不含F(xiàn)SP。將2種細(xì)胞分別傳代至第3代時(shí)，進(jìn)行消化，將細(xì)胞密度稀釋至1.0×106mL-1，取1 mL細(xì)胞懸液，離心去上清。針對(duì)FSP分別加入FSP-FITC單抗20 μL，充分混勻，室溫避光孵育20 min，2 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，用PBS溶液洗滌2次，分別加入PBS溶液0.5 mL，成為陰性對(duì)照細(xì)胞樣品和人羊膜成纖維細(xì)胞樣品，待測。②流式細(xì)胞術(shù)檢測：光源為488 nm氬離子激光器，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光，上機(jī)后收集1×105個(gè)細(xì)胞，以前向散射光(FSC)/側(cè)向散射光(SSC)二維散射光圖確定陰性對(duì)照細(xì)胞和人羊膜成纖維細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 人羊膜成纖維細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)熒光倒置顯微鏡下觀察：人羊膜經(jīng)含DNase酶的膠原酶溶液消化后收集細(xì)胞，24 h后大部分貼壁，貼壁2 d后細(xì)胞從爬片爬出(圖1A，見插頁四)；5 d后細(xì)胞生長迅速，增殖明顯，細(xì)胞數(shù)量明顯增多(圖1B，見插頁四)；8 d后可見細(xì)胞呈梭形、星形和多角形等多種形態(tài)，呈放射狀或旋渦狀分布，可見成纖維樣細(xì)胞克隆(圖1C，見插頁四)。

2.2 人羊膜成纖維細(xì)胞HE染色顯微鏡下觀察：HE染色后成纖維細(xì)胞體積較大且突起較多，細(xì)胞核被堿性的蘇木素染成紫藍(lán)色[10]，細(xì)胞質(zhì)被酸性染料伊紅染成紅色。見圖2(插頁四)。

2.3 人羊膜成纖維細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯微鏡下觀察：PBS對(duì)照組染色呈陰性，表明實(shí)驗(yàn)無假陽性現(xiàn)象；人羊膜成纖維細(xì)胞中Vimentin蛋白表達(dá)陽性，S100A4蛋白表達(dá)陽性，CK19蛋白表達(dá)陰性。見圖3(插頁四)。

2.4 人羊膜成纖維細(xì)胞生長曲線從細(xì)胞生長曲線可以看出，接種后1～2 d為細(xì)胞生長的潛伏期，也是細(xì)胞的貼壁階段；接種后3～5 d為細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞增殖活躍，呈指數(shù)級(jí)遞增；第6天后為細(xì)胞生長的平臺(tái)期，細(xì)胞增殖速度變慢，趨于平穩(wěn)。見圖4。

圖4 人羊膜成纖維細(xì)胞生長曲線

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測人羊膜成纖維細(xì)胞純度陰性細(xì)胞對(duì)照?qǐng)D中，細(xì)胞主要分布在第四象限，第二象限陽性細(xì)胞數(shù)量占0.135%，證明該檢測方法準(zhǔn)確可行(圖5 A)。人羊膜成纖維細(xì)胞主要分布在第二象限，為陽性細(xì)胞，數(shù)量占86.1%。表明分離得到的人羊膜成纖維細(xì)胞純度較高，準(zhǔn)確度好(圖5 B)。

A:Control group;B:Human amnion fibroblasts.

Fig.5 Purity of human amnion fibroblasts detected by FCM

3 討 論

人羊膜細(xì)胞為異質(zhì)性細(xì)胞群，主要由人羊膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成。目前尚未建立分離人羊膜成纖維細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化流程[11]。對(duì)人羊膜細(xì)胞的研究多采用單純胰蛋白酶或膠原酶消化和組織塊培養(yǎng)法獲得人羊膜細(xì)胞，但是通過胰蛋白酶消化的細(xì)胞絕大多數(shù)為羊膜上皮細(xì)胞。通過胰蛋白酶和膠原酶的先后消化進(jìn)行初步分離，膠原酶對(duì)纖維細(xì)胞有較強(qiáng)的消化作用，可獲得人羊膜成纖維細(xì)胞。在膠原酶進(jìn)行消化時(shí)，加入DNase酶，能夠破壞細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接，降低濾液黏度[12]，更容易獲得單個(gè)分散的、活力好的人羊膜成纖維細(xì)胞，這樣的細(xì)胞更容易貼壁生長。EGF存在于人體多種組織中，具有促進(jìn)角化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞生長的作用，并可促進(jìn)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白[13]，所以對(duì)人羊膜成纖維細(xì)胞的增殖可起到促進(jìn)作用。加入EGF的原代細(xì)胞比較容易貼壁，培養(yǎng)至3～5 d呈指數(shù)級(jí)增殖，第6天細(xì)胞增殖開始變慢，因此人羊膜成纖維細(xì)胞的傳代時(shí)間以培養(yǎng)4～5 d為宜。以PBS代替一抗，經(jīng)與細(xì)胞免疫組織化學(xué)同步染色后未見有陽性結(jié)果，所以排除假陽性的存在。 Vimentin為Ⅲ型中間絲蛋白，主要表達(dá)于中胚層起源的間充質(zhì)細(xì)胞中，在成纖維細(xì)胞內(nèi)大量分布，可作為成纖維細(xì)胞的標(biāo)記[14]。S100A4是鈣結(jié)合蛋白S100家族成員，其蛋白陽性表達(dá)部位主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)定位于細(xì)胞核。CK19為上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白[15]，在人羊膜成纖維細(xì)胞分離過程中，可能會(huì)摻雜部分人羊膜上皮細(xì)胞，所以CK19的陰性表達(dá)表明人羊膜成纖維細(xì)胞分離效果好，純度高。 流式細(xì)胞術(shù)是對(duì)懸液中的單細(xì)胞或其他生物粒子,通過檢測標(biāo)記的熒光信號(hào)[16]，實(shí)現(xiàn)高速、逐一的細(xì)胞定量分析和分選的技術(shù)。

本研究采用胰蛋白酶和膠原酶先后消化獲得了人羊膜成纖維細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞呈放射狀或旋渦狀生長，人羊膜成纖維細(xì)胞明顯表達(dá)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin，不同程度地表達(dá)S100A4，不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK19，采用流式細(xì)胞術(shù)分析人羊膜成纖維細(xì)胞的純度為86.1%。本研究成功建立了人羊膜成纖維細(xì)胞分離和鑒定方法，為今后的干細(xì)胞研究奠定了基礎(chǔ)。