宰后藏羊肉Hsp70表達量變化及其與肉品質相關性分析

張愛萍 師希雄 韓 玲 岳建偉 孫金龍 張有富

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，蘭州 730070； 2.河西學院農業與生物技術學院，張掖 734000)

0 引言

藏羊對高寒缺氧環境的極強適應能力以及耐粗飼、抗病力強、遺傳性狀穩定等優點使其成為甘南地區牧民重要的經濟和肉品來源。歐拉型藏羊是藏羊的一種，生活環境污染小，常年以放牧為主，肌間脂肪含量適中，粗蛋白、維生素和礦物質含量豐富，肉色鮮[1-2]。但因其系水力和熟肉率較低、肌纖維直徑稍粗，尤其是嫩度較差的特點影響了食用品質。

宰后成熟是改善肉品質的有效方法之一。肉成熟之后，嫩度、保水性、風味均得到明顯的改善，目前的研究成果認為，肉成熟過程中品質的改善主要歸因于肌原纖維蛋白的降解，然而，肉的成熟機理尚未明確。動物宰后的缺血缺氧激活了細胞凋亡酶，在誘導細胞凋亡的同時，應激誘導了具有高度保守性的一類非特異性細胞熱應激蛋白(Heat shock proteins，Hsps)的合成，其主要功能是作為分子伴侶與抗凋亡因子，可阻止宰后肌肉成熟過程所發生的細胞凋亡、蛋白降解等生理生化過程[3]。近些年，蛋白組學關于肉品質的研究表明，Hsps作為生物標記物在預測嫩度、肉色、保水性和風味方面具有一定的潛力[4-5]。目前，國內外關于Hsps的研究主要集中在醫學領域，對肉品質影響的研究主要集中在小分子熱休克蛋白(Small heat shock proteins, sHsps) 方面，如Hsp27和αβ-晶體。

HWANG等[6]經蛋白質組學分析研究認為：Hsp27含量與肌肉嫩度呈負相關；sHsps是一種分子伴侶，具有維持蛋白質完整性的功能，故肌肉中Hsp27與αβ-晶體含量的下降有利于肌動蛋白和肌球蛋白的降解，肌肉的嫩度得以提高。LOMIWES等[7]用免疫沉淀法研究安格斯小母牛背最長肌中Hsp27等幾種蛋白與μ-鈣蛋白酶之間的關系時發現，Hsp27在較嫩的肉樣中含量略低。

左惠心等[8]對牦牛肉通過蛋白質組學研究顯示，Hsp27是與牦牛肉保水性相關的蛋白之一。BERNARD等[9]對夏洛萊牛胸部肌肉進行研究時發現，Hsp27和αβ-晶體蛋白含量與肌肉的嫩度和持水性呈顯著負相關，Hsp27在肌肉中表達量的下調能夠改善肉的嫩度、多汁性和風味。張淼[10]研究發現，宰后運輸應激過程中豬肉Hsp27含量與韌性、a*值呈正相關，與L*值和b*值呈負相關。

Hsp70是熱休克蛋白之一，動物宰后的缺血缺氧應激誘導Hsp70的合成，在動物宰后肉成熟過程中Hsp70對肉品質的影響鮮有報道，尤其對藏羊肉品質的影響未見報道。本文研究藏羊肉宰后成熟過程中Hsp70表達量與肉品質指標的變化，同時，分析Hsp70表達量與肉品質指標的相關性，以期為藏羊肉宰后成熟過程中Hsp70對食用品質的影響提供理論依據，從而豐富藏羊肉成熟機理，進一步改善藏羊肉品質。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料：選取甘南藏族自治州自然放牧條件下健康無病、發育正常、體重相近的4～5歲歐拉藏母羊24只，宰前禁食10～15 h，只提供飲水。

試驗試劑：KCl，K3PO4，EDTA，MgCl，NaN3，均為分析純；RIPA組織裂解液，苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)，北京索萊寶科技有限公司。

羊熱休克蛋白70(Hsp70)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒，上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 試驗儀器

PHS2-2型酸度計(上海雷磁公司)，CR-400型色差儀(日本Konika-Minolta 公司)，HI99163型便攜式肉類pH計(意大利哈納HANNA儀器公司)，C-LM4型數顯式肌肉嫩度儀(東北農業大學工程學院)，YYW-2型應變控制式無側限壓力儀(南京土壤儀器廠有限公司)，HHS型數顯電熱恒溫水浴鍋(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)，BSA224型電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)，XHF-D型高速分散器(寧波新芝生物科技股份有限公司)，XH-B型渦旋混合器(江蘇康健醫療用品有限公司)，TGL-24M型臺式高速冷凍離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)，SP-756P 型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，iMark Microplate Reader型酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品采集與制備

隨機選取24只年齡體重相近的歐拉藏羊為試驗對象，宰前禁食并且隨機編號，盡量減小屠宰過程中的應激。宰后30 min內迅速取下背最長肌，并在一側背最長肌上取下少許肉樣作為第0天肉樣，用錫箔紙包裹后保存于液氮中待測；其余肉樣置于4℃環境中成熟，并分別于宰后2、12、24、48、72、120、168 h取樣，取得的樣品在-80℃超低溫冰箱中保存，隨后進行Hsp70表達量、pH值、肉色、剪切力、系水率、蒸煮損失、肌原纖維小片化指數(MFI)、糖原含量的測定。

1.3.2Hsp70表達量

蛋白樣品的制備：參照SALOKHE等[11]的方法并改進，將保存于-80℃冰箱中的肉樣組織取出，于4℃恒溫恒濕(相對濕度85%)箱解凍至半凍狀態，除去表皮脂肪和筋膜，切成小塊。準確稱取150 mg樣品置于研缽中，加入1.5 mL RIPA組織裂解液、15 μL PMSF充分研磨，將研磨后的組織液轉移到玻璃勻漿器中勻漿1 min，以充分裂解組織細胞，將勻漿液移至3 mL離心管中離心(12 000g，4℃，20 min)，離心完畢后將上清液移至另一EP管中于-80℃保存備用。

Hsp70表達量的檢測：參照試劑盒說明書并參照YU等[12]的方法，采用ELISA分析法檢測Hsp70的含量。將4℃冰箱中保存的試劑盒取出，室溫(20℃)下平衡30 min后，對已經制備好的樣品進行ELISA分析法檢測。

在Excel工作表中，以試劑盒里Hsp70的不同質量濃度梯度標準品質量濃度為橫坐標，對應450 nm處 OD值為縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線(設定系數R2≥0.990 0)，按曲線方程計算各樣品Hsp70質量濃度，即Hsp70表達量。

1.3.3pH值

采用 HI99163 型便攜式肉類pH計(帶35 mm不銹鋼刀頭)，用蒸餾水沖洗肉樣上的血漬，并用干凈濾紙吸干表面殘留水分，隨機選擇3個不同部位的肉樣將pH計探頭插入肉中進行測定，并使電極與肉樣接觸良好，待其讀數穩定后記錄，取平均值。

1.3.4色度

采用CR-400型色差儀進行測定。測量前先用標準白板對色差儀進行校正，每個肉樣選取3處測定求其平均值，包括亮度L*、 紅色度a*、 黃色度b*。

1.3.5系水率

選取不同成熟時間點的樣品，切成約1 cm2小塊，精確稱取10 g于離心管中，2 500g、4℃下離心30 min，取出肉樣用定性分析濾紙吸去表面滲出的多余水分，稱量并測定失水率。每個樣品做3個平行，取平均值。水分含量測定參照GB/T 9695.15—2008《肉與肉制品 水分含量測定》。

式中A——系水率，%

B——含水率，%

C——失水率，%

D——離心前樣品質量，g

E——離心后樣品質量，g

1.3.6剪切力

取厚約4 cm、質量100 g左右的肉樣(除去表面脂肪和結締組織)，裝入蒸煮袋中，將溫度計插入至肉樣中心，用夾子封口，放入80℃水浴鍋中進行蒸煮，當肉樣中心溫度達到70℃時開始計時，使肉樣中心溫度保持在70℃繼續煮30 min后，取出冷卻至室溫，后用1.27 cm的取樣器沿肌纖維方向鉆取測定樣品，用嫩度儀測定剪切力，每組重復3次，取平均值。

1.3.7肌原纖維小片化指數

參照DELGADO等[13]及孫志昶等[14]的研究方法，取0.8 g肉樣，用8 mL的MFI(肌原纖維小片化指數)緩沖液(100 mmol/L KCl、20 mmol/L K3PO4、1 mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3，pH值7.1)，將肉研磨均質化。所得懸濁液在1 000g、4℃下離心15 min，棄去上清液，沉淀后再用8 mL的MFI緩沖液使其重新處于懸濁態，再于1 000g、4℃離心15 min，棄去上清液。沉淀后用5 mL的MFI緩沖液使之重新處于懸濁態，用200目尼龍篩網過濾該懸濁液，另用5 mL MFI 緩沖液幫助肌原纖維蛋白通過濾網。過濾所得的肌原纖維蛋白懸濁液用雙縮脲法測定其蛋白含量，然后用MFI緩沖液將其質量濃度稀釋至0.5 mg/mL，最后在540 nm下測定其吸光度，將結果乘以200，就是肌原纖維小片化指數。

1.3.8糖原含量

取試樣少許,解凍后經生理鹽水漂洗再用濾紙吸干，然后精確稱1 000 mg放入離心管內，加入5%的三氯醋酸4 mL，用組織分散器以26 000 r/min分散60 s，在15 000g、4℃下離心15 min，將上清液移入另一試管內。在沉淀內加入5%的三氯醋酸4 mL，勻漿1 min后，于上述條件(15 000g、4℃)離心15 min,將上清液移入試管內與第1次離心的上清液合并，用振蕩混合器充分混勻。取上清液1 mL放入10 mL離心管中，加入95%乙醇4 mL，充分混勻至兩種液體間沒有分界面。用干凈塞子塞上，室溫下靜置12 h。然后在15 000g、4℃下離心10 min,棄去上清液后，試管倒置10 min以控干后，逐次加入3 mL蒸餾水，振蕩管子至糖原完全溶解，移入20 mL試管中。剩余步驟與標準曲線繪制的試驗方法相同。用M×8/1000×0.9×100計算糖原含量(質量比,單位mg/g)，其中M表示對照標準曲線查得1 mL提取液中的葡萄糖含量，單位mg。

1.4 統計分析

試驗所得數值均采用平均值±標準差表示，采用Excel及SPSS 19.0數據統計分析軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 Hsp70表達量

Hsp70具有抗細胞凋亡功能，保護組織免受氧化應激[15]，蛋白質組學的研究證明，Hsp70是與嫩度有高度關系的蛋白，在剪切力低的肉中其表達量較低[16]。由圖1(圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同)分析得出，宰后藏羊肉成熟過程中Hsp70的表達量總體呈逐漸下降的趨勢，宰后12 h Hsp70的表達量達到最大，宰后12～120 h內Hsp70表達量表現為顯著下降。相比于宰后12 h，宰后24、72、120 h的Hsp70表達量分別下降了38.84%、61.71%、91.72%。宰后初期，由于動物缺血缺氧引起應激反應，產生的Hsp70表達量迅速增加，阻止了細胞凋亡的發生，使肉的嫩度降低，之后隨著成熟過程Hsp70表達量逐漸降低，嫩度逐漸升高。

圖1 宰后成熟過程藏羊肉Hsp70表達量的變化Fig.1 Change of Hsp70 concentration of Tibetan sheep meat during postmortem aging

2.2 pH值

pH值是反映動物屠宰后糖元酵解速度和強度的重要指標，能更直觀地體現機體生成乳酸的含量，動物在宰后由于糖原的酵解，發生無氧呼吸產生乳酸等物質，肌肉的pH值不斷下降，用pH值可以判斷宰后肉品的成熟情況。如圖2所示，隨著成熟時間的延長，宰后2～24 h藏羊肉的pH值顯著降低，此結果與王薇等[17]對寧夏灘羊成熟過程pH值變化的研究結果一致。宰后肉品隨著成熟的進程，24 h后pH值逐漸上升。宰后初期由于供氧中斷糖原被分解而產生大量乳酸，pH值大幅度下降，直到肌動球蛋白等電點，隨著H+濃度的升高，與糖酵解相關的酶被鈍化酵解速度和程度逐漸減小，pH值回升。

圖2 宰后成熟過程藏羊肉pH值的變化Fig.2 Change of pH value of Tibetan sheep meat during postmortem aging

2.3 色度

由圖3可知，宰后成熟過程中藏羊肉L*、a*及b*均有一定的變化。L*變化呈先升高后降低的趨勢，24 h時達到最大值，這與李澤等[18]對宰后羊肉、吳菊清等[19]對牛肉及豬肉和田甲春等[20]對牦牛肉中L*的研究結果相似。肉色變化主要是由肌紅蛋白在脫氧、氧合和高鐵肌紅蛋白3種形態之間變化所決定的[21]。a*的變化與肌紅蛋白的含量和化學狀態密切相關，成熟初期因亞鐵肌紅蛋白結合氧生成氧合肌紅蛋白，a*逐漸升高，隨著成熟過程中與空氣的接觸，鮮紅色的氧合肌紅蛋白逐漸變成高鐵肌紅蛋白，a*降低。

圖3 宰后成熟過程藏羊肉色度的變化Fig.3 Change of chromaticity of Tibetan sheep meat during postmortem aging

2.4 系水率

肉的系水率可以表征肌肉受到外力(壓力、切碎、冷凍、解凍、貯存、加工等)作用時，其保持原有水分與添加水分的能力。由圖4可知，宰后2 h藏羊肉的系水率最高，保水性最好，隨著成熟的進程，在2～24 h系水率顯著降低，72 h時系水率達到最低，之后有顯著回升。動物宰后肌肉中因糖酵解生成的乳酸使肉 pH值迅速降低，肉中肌漿蛋白凝結到肌原纖維上，蛋白質溶解度下降，造成了水分的流失，系水率下降。同時pH值的快速下降，破壞了肌肉蛋白質電荷間的平衡，蛋白質帶凈負電荷的數量減少，pH值下降到接近肌肉蛋白質的等電點(5.4)時，蛋白質的凈電荷為零，大量水分被壓迫擠出，此時系水率最低，保水性最差[22-23]。

圖4 宰后成熟過程藏羊肉系水率的變化Fig.4 Change of WHC of Tibetan sheep meat during postmortem aging

2.5 剪切力

嫩度是消費者在選擇肉品時非常關注的重要指標之一，而剪切力是評價肉品宰后成熟過程中嫩度的重要而廣泛使用的指標[24]。由圖5可知，剪切力呈先增大后顯著減小的趨勢，宰后24 h達到最大值7.37 N。其原因是成熟初期，因為肌節的收縮會進入僵直狀態，肌肉中肌球蛋白、肌動蛋白等達到等電點，蛋白凝固、肌纖維硬化，此時嫩度最差，另一方面，在成熟2～12 h，Hsp70表達量升高，抑制了細胞凋亡的發生，系水能力加強，使得剪切力升高，嫩度降低。隨之，Hsp70表達量逐漸降低，細胞凋亡酶發生作用，將肌肉結構破壞，剪切力逐漸降低，嫩度增加。YANG等[25]用NaN3處理牛肉，經過單層融合、成肌細胞融合等前處理的細胞，細胞內Hsp70 表達量增加，因Hsp70與缺氧條件下的細胞凋亡相關，被認為是與宰后早期的蛋白降解和肉的嫩度有關。PICARD等[26]和CARVALHO等[16]的研究也驗證了宰后初期Hsp70 表達量的增加引起肉剪切力的增大。

圖5 宰后成熟過程藏羊肉剪切力的變化Fig.5 Change of shear force of Tibetan sheep meat during postmortem aging

2.6 肌原纖維小片化指數

MFI可直接反映肌原纖維蛋白被降解及肌原纖維結構破壞的程度，可以衡量嫩度的高低。本研究發現，藏羊宰后MFI顯著升高主要發生在成熟約120 h以內，之后上升的速率和幅度減弱，如圖6所示，這與VEISETH等[27]對綿羊背最長肌的研究結果一致。在肉品宰后成熟過程中，MFI與鈣激活酶活性呈極顯著相關[19]，隨著鈣激活酶被激活，作用于肌原纖維結構的Z線后，使之受到持續的張力，導致其斷裂、崩解，MFI隨之增大。KEMP等[28]研究顯示細胞凋亡過程中 caspase-3 表達水平的升高和肌細胞凋亡小體的形成使凋亡程度加深，破壞肌原纖維蛋白結構，也會使MFI增大。

圖6 宰后成熟過程藏羊肉MFI的變化Fig.6 Change of MFI of Tibetan sheep meat during postmortem aging

2.7 糖原含量

糖原作為肌肉主要的儲能物質，宰后胴體通過無氧酵解來提供胴體生化反應所需的能量。如圖7所示，宰后成熟過程藏羊肉中糖原含量整體呈下降趨勢。糖原在成熟初期糖酵解速率下降顯著；宰后3 d之后隨成熟時間的延長，糖原含量的下降速率逐漸趨于零。原因主要是肌糖原在無氧酵解過程中產生大量乳酸，導致胴體的pH值下降，當達到酸性極限pH值時，將會抑制參與無氧糖酵解酶的活性。

圖7 宰后成熟過程藏羊肉糖原含量的變化Fig.7 Change of glycogen of Tibetan sheep meat during postmortem aging

2.8 Hsp70表達量與肉品質參數的相關分析

由表1可知，藏羊在宰后成熟過程中Hsp70表達量與MFI呈極顯著負相關(P<0.01)，與L*呈顯著負相關(P<0.05)，與剪切力、糖原含量呈顯著正相關(P<0.05)，與系水率呈極顯著正相關(P<0.01)，與a*、b*無顯著相關性。Hsp70 是一類能特異性表達、具有抗細胞凋亡功能的熱休克蛋白，能保護組織免受氧化應激，是反映肉品質的一個潛在生物標志物，通過對細胞凋亡和細胞膜的調控，會對肉品保水性和嫩度產生一定影響[5,26,29]。GUILLEMIN等[30]通過基因組學等分析牛肉嫩化的細胞途徑時發現，牛半腱肌中 Hsp70表達量與肉嫩度強負相關。本試驗結果顯示Hsp70表達量與剪切力呈顯著正相關(P<0.05)，與MFI呈極顯著負相關(P<0.01)，這與D’ALESSANDRO等[31]和CARVALHO等[16]的研究結果一致。上調Hsp70表達量有助于維持肌細胞的完整性，修復變性的蛋白，抑制細胞凋亡的發生，阻止肌原纖維蛋白的降解[32]。DI等[5]通過蛋白質組學對不同滴水損失的豬肉在成熟過程中保水性的研究發現，熱休克蛋白豐度下降引起滴水損失的增加，二者呈負相關，滴水損失大則系水率低，與本文研究結果Hsp70表達量與系水率呈極顯著正相關(P<0.01)相一致。ZHANG等[33]研究表明雞胸肉中Hsp70表達量與滴水損失呈正相關，與本結果不一致，可能是試驗材料存在差異或樣品處理方式不同所導致。

表1 Hsp70表達量與肉品質的相關性分析Tab.1 Correlation analysis between Hsp70 concentration and meat quality

3 結論

(1)藏羊背最長肌宰后成熟過程中，Hsp70表達量在宰后最初的2～12 h升高達到最高量之后顯著下降(P<0.05)，120 h后下降趨勢緩慢。

(2) Hsp70表達量與MFI呈極顯著負相關(P<0.01)，與L*呈顯著負相關(P<0.05)，與剪切力、糖原含量呈顯著正相關(P<0.05)，與系水率呈極顯著正相關(P<0.01)。