安胃湯對慢性萎縮性胃炎模型大鼠細胞凋亡因子表達的影響*

李鐵軍,魏書堂,李 惠,張 威,王慧超

河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院(開封 475001)

主題詞 胃炎, 萎縮性/中醫(yī)藥療法 @安胃湯 動物實驗 大鼠

慢性萎縮性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)是我國常見的消化系統(tǒng)疾病之一，主要表現(xiàn)為腹痛腹脹、惡心嘔吐、噯氣、食欲減退等，嚴重者甚至出現(xiàn)貧血[1]。近年來，隨著生活方式的改變，慢性萎縮性胃炎的發(fā)病率呈明顯增高趨勢，目前已被認為是一種癌前病變，其癌變的進程是慢性萎縮性胃炎-腸上皮化生-不典型增生-胃癌[2]，該進程是難以逆轉(zhuǎn)的，但是如何阻斷疾病的發(fā)展是研究的熱點。已有大量研究顯示，胃黏膜細胞增殖與凋亡功能的紊亂是CAG主要病理環(huán)節(jié)，其中最關(guān)鍵的因素是細胞的異常凋亡，與細胞凋亡有關(guān)的因子可分為促細胞凋亡因子和抑凋亡因子[3]。西醫(yī)以抑制胃酸和抗幽門螺桿菌治療為主，主要是緩解患者癥狀，對阻斷疾病進展作用不明顯。中醫(yī)藥治療CAG有獨特優(yōu)勢，一方面能夠改善病情，另一方面從整體出發(fā)，調(diào)節(jié)機體修復(fù)能力，而且治療費用低，易推廣[4]。本次研究，筆者通過對CAG模型大鼠采用安胃湯治療，觀察其對相關(guān)細胞凋亡因子的影響，探討藥物的作用機制，現(xiàn)將結(jié)果做如下報道。

材料與方法

1 動 物 健康清潔級wistar大鼠62只，雄性，體重151～200 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SCXK(湘)2014-0005。分籠飼養(yǎng)：溫度(24±2) ℃，濕度70%±10%，自由飲食水。

2 主要藥物與試劑 安胃湯免煎顆粒(由黃連5 g，丹參、百合各15 g，白芍20 g，法半夏、烏藥各10 g，干姜、炙甘草各6 g組成)：我院藥劑科提供。胃復(fù)春片產(chǎn)自杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，規(guī)格0.36 g/片，國藥準字號2017021510。甲基硝基亞硝基胍(MNNG)購于日本東京化成株式會社;10%水合氯醛購于青島宇龍海藻有限公司;無水乙醇購于濟寧銘達新材料有限公司;蘇木精伊紅染色試劑盒、RIPA 組織裂解液購于武漢博士德生物有限公司;BCA 蛋白定量試劑盒購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司;羅氏TUNEL試劑盒購于北京嘉美紐諾生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于 Thermo公司;鼠抗Bax、Bcl-2、Fas、FasL抗體購于abcam公司;PCR 引物購于北京諾賽基因組研究中心有限公司。

3 主要儀器 光學(xué)顯微鏡，購于洛陽惠爾納米科技有限公司;Ultrospec 8000紫外-可見光分光光度計購于通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)貿(mào)易發(fā)展(上海)有限公司;KD-BM 型包埋機購于金華科迪儀器設(shè)備有限公司;組織搗碎勻漿機，購于天津博天勝達科技發(fā)展有限公司;高速低溫離心機購于sigma公司;Stratagene MX3000P熒光定量 PCR 儀購于安捷倫公司;DF2C 型電泳儀購于北京六一儀器廠。

4 實驗方法 從62只大鼠中隨機抽取10只大鼠作為空白對照組(A組)，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，剩余52只建立CAG模型，造模方法：①將150 mg/L的MNNG溶液加入飲用水中，自由飲水；②饑飽失常喂養(yǎng)，即足量喂食2 d，禁食1 d，循環(huán)進行；③采用專用夾尾夾夾大鼠尾巴，15 min/(次·d)，以保持憤怒狀態(tài)，普通飼料喂養(yǎng)，連續(xù)8周。然后隨機抽取2只大鼠處死，取胃觀察胃黏膜形態(tài)判斷造模是否成功。造模成功，將模型大鼠分為模型組(B組)、胃復(fù)春組(C組)、安胃湯低劑量組(D組)、安胃湯中劑量組(E組)、安胃湯高劑量組(F組)。C組給予胃復(fù)春懸濁液(將胃復(fù)春片研磨后溶于飲用水，制成濃度為0.09 g/ml的懸濁液)，按照0.078g/100(g·d)的劑量灌胃。D、E、F組分別給予0.5、1.0、2.0 g/100(g·d)劑量的安胃湯(將安胃湯顆粒溶于飲用水，制成濃度1.0 g/ml的懸濁液)灌胃。A、B兩組給予3 ml生理鹽水灌胃。所有大鼠均在每日上午灌胃，連續(xù)4周。

5 取材與檢測

5.1 取材: 所有大鼠灌胃治療結(jié)束后，繼續(xù)飼養(yǎng)12周，禁食不禁水12 h后，用10%水合氯醛對大鼠進行腹腔麻醉，剖腹，取出全胃，取四塊胃大彎至胃竇部幽門處的胃黏膜組織。

5.2 制備切片: 將 5.1取得的一塊胃黏膜組織用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片(厚度為5 μm)，70 ℃烘干30 min，二甲苯中脫蠟10 min，再次脫蠟10 min，梯度乙醇沖洗，洗去二甲苯，然后用蒸餾水洗2 min，蘇木精染色5 min，蒸餾水沖洗1 min，1%鹽酸酒精分化30 s，蒸餾水中浸泡10 min，伊紅染色5 min，蒸餾水沖洗30 s，梯度乙醇脫水各5 min，再用二甲苯透明5 min(2次)，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察胃黏膜組織形態(tài)。

5.3 QRT-PCR法檢測胃黏膜組織中Bax、Bcl-2、Fas、FasL mRNA的表達:將取得的一塊胃黏膜組織用Trizol法提取總RNA，用紫外分光光度法測總RNA濃度在1.8～2.0之間方可用，體外反轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)cDNA，設(shè)計引物進行DNA擴增；引物：Bax: 5’-CGAGCTGATCAGAACCATCA-3’(上游)、5 ’-AAGCCTCAGCCCATCTTCTT-3’(下游)，擴增產(chǎn)物84bp；Bcl-2：5’-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3’(上游)、5＇-CATGCTGGGGCCATATAGTT -3’(下游)，擴增產(chǎn)物86bp；Fas：5’-AAGATCCCGGAAAGCAAGAT-3’(上游)，5’-TAAAGCTTGACACGCACCAG-3’ (下游)，擴增產(chǎn)物349bp；FasL：5’-CAGCAGCCCTTGAATTACC-3’(上游)，5’-CTCCATCAGCACCATGTCC-3’(下游)，擴增產(chǎn)物 285 bp；GAPDH：5’-AGGTCGGAGTCAACGGATTT -3’(上游)、5 ’-TGACGGTGCCATGGAATTTG-3’(下游)，擴增產(chǎn)物93 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃30 s，退火50 ℃1 min，延伸72℃30 s，循環(huán)40次，采用相對定量方法的雙標準曲線法分析結(jié)果，然后計算Ct值，根據(jù)出Bax、Bcl-2、Fas、FasL 復(fù)制數(shù)與GAPDH復(fù)制數(shù)，得到mRNA的相對表達量。

5.4 Western-blot法檢測胃黏膜組織中Bax、Bcl-2、Fas、FasL蛋白的表達：將取得的一塊胃黏膜組織采用RIPA組織裂解液提取總蛋白，進行總蛋白定量，計算出上樣體積，然后對上樣蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后轉(zhuǎn)膜，5 %脫脂乳封閉1 h，一抗Bax、Bcl-2、Fas、FasL、β-actin 1∶1000稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，10 min/次，二抗1∶3000稀釋，室溫慢速搖擺孵育1 h，TBST洗滌3次，10 min/次，采用ECL試劑盒孵育壓片，暗室顯影洗片，掃描膠片，測定灰度值度，以β-actin 為參照，計算蛋白相對表達量。

5.5 TUNEL法檢測胃黏膜細胞凋亡指數(shù)：將取得的一塊胃黏膜組織制作石蠟切片，按照TUNEL試劑盒操作說明書進行染色，細胞核呈棕褐色的即為凋亡細胞，光學(xué)顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，計算凋亡指數(shù)=凋亡細胞/視野內(nèi)細胞總數(shù)×100%，每張切片選取5個視野，取平均值。

結(jié) 果

1 各組大鼠胃黏膜組織病理改變的比較 A組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，各層排列正常，固有腺體排列整齊，無萎縮。B組胃黏膜明顯萎縮，細胞排列紊亂，不規(guī)則，固有腺體萎縮消失，伴變性壞死。C組胃黏膜結(jié)構(gòu)較整齊，固有腺體排列略紊亂，數(shù)目有減少。D、E、F組胃黏膜結(jié)構(gòu)完整度呈遞增趨勢，固有腺體萎縮程度降低，數(shù)目增加，明顯優(yōu)于B組(圖1)。

2 各組大鼠胃黏膜組織中Bax、Bcl-2、Fas、FasL mRNA相對表達量的比較 見表1。與A組相比，B組Bcl-2 mRNA相對表達量降低，Bax、Fas、FasL mRNA相對表達量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與B組相比，C、D、E、F組的Bcl-2 mRNA相對表達量升高，Bax、Fas、FasL mRNA相對表達量降低(P<0.05)；與C組相比， E、F組的Bcl-2 mRNA相對表達量升高，Bax、Fas、FasL mRNA相對表達量降低(P<0.05)；C組與D組之間無明顯差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠胃黏膜組織中Bax、Bcl-2、Fas、FasL mRNA相對表達量的比較

注：與A組比較，△P<0.05；與B組比較，▲P<0.05；與C組比較，*P<0.05；與D組比較，◇P<0.05；與E組比較，□P<0.05

3 各組大鼠胃黏膜組織中Bax、Bcl-2、Fas、FasL 蛋白表達量的比較 見表2。與A組相比，B組Bcl-2 蛋白表達量降低，Bax、Fas、FasL 蛋白表達量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與B組相比，C、D、E、F組的Bcl-2 蛋白表達量升高，Bax、Fas、FasL 蛋白表達量降低(P<0.05)；與C組相比， E、F組的Bcl-2 蛋白表達量升高，Bax、Fas、FasL 蛋白表達量降低(P<0.05)；C組與D組之間無明顯差異(P>0.05)。

表2 各組大鼠胃黏膜組織中Bax、Bcl-2、Fas、FasL 蛋白表達量的比較

注：與A組比較，△P<0.05；與B組比較，▲P<0.05；與C組比較，*P<0.05；與D組比較，◇P<0.05；與E組比較，□P<0.05

4 各組大鼠胃黏膜細胞凋亡指數(shù)的比較 見表3。 與A組相比，B組凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05)；與B組相比，C、D、E、F組凋亡指數(shù)均下降(P<0.05)；與C組相比，D、E、F組凋亡指數(shù)均下降，且隨著劑量的升高，下降程度更明顯(P<0.05)。

表3 各組大鼠胃黏膜細胞凋亡指數(shù)的比較(%)

注：與A組比較，△P<0.05；與B組比較，▲P<0.05；與C組比較，*P<0.05；與D組比較，◇P<0.05；與E組比較，□P<0.05

討 論

目前普遍認為CAG到胃癌的進程是慢性萎縮性胃炎-腸上皮化生-不典型增生-胃癌，主要的發(fā)病機制是細胞增殖與凋亡的失衡，細胞凋亡受到凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控[5]，包括Fas家族、Bcl-2家族與caspase家族等。Bcl-2是Bcl-2家族的抑凋亡因子[6]，胃黏膜細胞的Bcl-2蛋白主要分布于腺體的體部和頸部，隨著CAG的進展，Bcl-2蛋白的分布會逐漸覆蓋胃黏膜全層，使細胞異常增殖，形成癌變，Bcl-2主要是通過抑制細胞的凋亡，延長細胞生存期。Bax是Bcl-2家族的促凋亡因子，可通過結(jié)合Bcl-2，抑制Bcl-2的抗凋亡作用，因此有學(xué)者[7]提出Bax/Bcl-2平衡的失調(diào)是胃癌發(fā)生的重要機制。Fas是一類跨膜糖蛋白，屬于腫瘤殺傷因子(TNF)的超家族成員，主要分布于糖基化的細胞表面，主要促進細胞凋亡。FasL是Fas的配體，與之結(jié)合后，可以活化細胞凋亡信號并傳遞，拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用[8]。

CAG到胃癌發(fā)展的不同階段中，胃黏膜細胞的增殖與凋亡平衡是不斷變化的。在CAG時，細胞的凋亡與增殖均增加，細胞過度凋亡從而形成黏膜的萎縮改變，而在不典型增生階段，細胞凋亡障礙，增殖繼續(xù)增加，從而發(fā)生增生[9]。這在本次研究中也得到證實，模型組大鼠抑凋亡因子Bcl-2表達降低，促凋亡因子Bax、Fas、FasL 表達升高，凋亡指數(shù)顯著升高。

中醫(yī)根據(jù)CAG的臨床癥狀，將其納入“胃脘痛”、“痞滿”等范疇，以痞滿居多，早在《傷寒論》就有記載“滿而不痛，此為痞”。CAG的病機以脾胃虧虛為主，脾胃虛弱，氣血運行紊亂，加上外邪入侵，形成濕毒、火毒，使脾胃經(jīng)絡(luò)受損，引發(fā)慢性萎縮性胃炎。針對此病機，筆者自擬安胃湯，方中黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，藥理研究顯示[10]其具有較強的抑菌、抗腫瘤作用，還能夠升高胃蛋白酶原和胃泌素水平，促進胃黏膜生長。百合有清瀉胃熱的作用，搭配烏藥可養(yǎng)津護胃、行氣散寒;法半夏和胃，合干姜可降逆燥濕、散瘀開結(jié);白芍柔肝止痛、解郁生津;丹參行氣活血，輔以甘草調(diào)和諸藥，并加強藥力。

綜上所述，安胃湯治療CAG大鼠，能夠通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、Fas、FasL等細胞凋亡因子水平，抑制胃黏膜細胞凋亡，改善胃黏膜萎縮，效果與安胃湯劑量正相關(guān)。但是安胃湯中藥理作用復(fù)雜，具體是哪些分子發(fā)揮調(diào)控作用還需要進一步的研究探索。