疏肝補腎法對慢性應激模型小鼠子宮內膜容受性的調節及作用研究*

趙嘉梅， 張愛華，黃紫微,王希浩

1.河南省中醫藥研究院附屬醫院婦科(鄭州 450000)，2.南京中醫藥大學(南京210023)

主題詞 不育, 女性/中醫藥療法 @疏肝補腎 動物實驗 小鼠

我國女性從事社會活動、工作的比例不斷上升，隨著全社會經濟的飛速發展，我國居民生活、工作節奏日益加快[1-3]。長期慢性應激狀態使部分女性在生理、心理等多重慢性刺激作用下發生了不同程度的排卵功能障礙、黃體功能異常、子宮內膜容受性(Endometrial receptivity，ER)受損等生理病變[4-6]。從而對妊娠需求、生理健康以及心理等形成了不良影響。西醫西藥為對癥治療模式，對于慢性刺激所至的子宮內膜容受性降低而形成的相關疾病尚無特效療法。中醫理論認為本病屬于“肝郁證”的范疇。為了深入研究中醫疏肝補腎中藥對于慢性應激性子宮內膜容受性減低而誘發的不孕癥，我們選取疏肝補腎經典方藥，開展本次動物建模實驗,現將詳細研究內容與結果總結于后文。

資料與方法

1 實驗動物 自河南省實驗動物中心購進SPF級的KM雄性小鼠50只，日齡為28～32 d；SPF級的KM雌性小鼠80只，日齡為21～28 d,許可證號：SCK(豫)2015-0002，合格證號：No.41003100002729。

2 實驗用藥 逍遙丸(國藥準字Z41021831)，配制為濃度0.3 g/ml的混懸液備用；滋腎育胎丸(國藥準字Z44020008)，配制為濃度0.3 g/ml的混懸液備用。疏肝補腎中藥，方劑組成：菟絲子、仙靈脾、肉蓯蓉各30 g，熟地20 g，山萸肉、枸杞子、當歸、生白芍、制香附各15 g，柴胡、鹿角霜、制龜版、炒白術各12 g，雞內金9 g；孕后方，方劑組成：黃芪、熟地、菟絲子各30 g，生白芍、黨參、炒白術、枸杞子各15 g，川斷、杜仲、桑寄生各12 g，柴胡、紫蘇梗、黃芩各9 g，砂仁6 g；以上藥材生藥按原方劑量20倍取材制劑，制成1.21 g/ml流浸膏備用。上述中藥材均購自同仁堂中藥飲片有限公司。

3 建模與分組方法 自全部雌鼠中隨機選取20只歸入空白組，其余60只制備為慢性應激小鼠模型。空白組選取15只精神狀態良好的雌鼠進入下一階段實驗；自60只慢性應激小鼠模型中選取45只建模最為成功的隨機均分為模型組、陽性對照組與中藥觀察組進入下一階段實驗。

慢性應激小鼠模型依據相關文獻方法制備[7]。對60只雌性小鼠給予慢性刺激持續21 d，刺激操作包括：15 min起動～300次/min振幅為20 MM的水平震蕩、24 h禁水、24 h禁食、以150 ml純凈水注入籠底墊料使墊料保持濕潤24 h、束縛3 h、10 MA的10 S/次足底電刺激間隔30 s連續20次、24 h晝夜顛倒、有威脅性的陌生氣味、40DB的10 S/次噪音刺激間隔30 s連續20次等刺激，每天隨機進行一種刺激，每種刺激重復3次。刺激結束后，對60只小鼠進行曠場試驗、懸尾試驗、稱量體重；曠場試驗，記錄小鼠在3 min內完成的水平穿格數、在中央格的停留時間、直立的次數、修飾的次數、糞粒數；懸尾實驗，固定小鼠尾部，使其在三面封閉環境下倒置懸掛6 min，記錄倒懸后4 min內的靜止時間；通過統計上述數據進行分析確定建模成功。

4 實驗方法 空白組15只小鼠持續常規喂養，正常飲食、休息、活動，保持健康，不予任何藥物干預，持續21 d后合籠，至見栓后第5天。模型組15只小鼠于建模成功后持續常規喂養，喂養方法與空白組相同，不予任何藥物干預，持續21 d后合籠，至見栓后第5天。觀察組于建模成功后給予疏肝補腎中藥流浸膏，按1 ml/100 g(體重)灌胃，持續21 d后合籠，合籠后給予孕后方按1 ml/100 g(體重)灌胃至見栓后第5天。陽性對照組于建模成功后給予逍遙丸混懸液，按1 ml/100g灌胃，持續21 d后合籠，合籠后給予滋腎育胎丸混懸液按1 ml/100 g(體重)灌胃至見栓后第5天。

5 觀察指標與方法 觀察組各組小鼠建模后21 d時的體重及行為學指標：中央格停留時間、水平穿格數、直立次數、懸尾靜止時間。實驗結束后統計見栓率與著床數以及子宮內膜VEGF、LIF的表達水平。

各組小鼠均于建模后21 d晚按1∶1比例與雄性小鼠合籠，見陰栓日記為妊娠第1 d，未見陰栓的連續合籠5天至見到陰栓為止。于妊娠第5 d晨，以后頸椎脫臼法將各組小鼠處死，解剖后統計著床數并取子宮內膜，制作石蠟切片以免疫組化法于高倍電子顯微鏡下觀察VEGF、LIF在子宮內膜的表達水平。

6 統計學方法 全部實驗數據均錄入至SPSS 20.0軟件進行統計學處理。計量數據以Kolmogorov-Smirnov檢驗分布狀態，以單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗差異性，進一步兩兩對比采取LSD-L分析，符合正態分布的數據以Mean±SD表述，偏態分布數據以M×25%～×75%)表述；計數數據以卡方檢驗；P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 各組行為學指標比較 見表1。各組間中央格停留時間、水平穿格數、直立次數、懸尾靜止時間差異具有統計學意義(P<0.05)；經進一步兩兩對比，各組間各項行為學指標差異均具有統計學意義(P<0.05)。

2 各組見栓率與著床數比較 見表2。各組間見栓率差異具有統計學意義(P<0.05)，進一步對比觀察組與空白組、模型組與陽性對照組間見栓率無統計學差異(P>0.05)；其余各組間差異均具有統計學意義(P<0.05)；觀察組胚胎著床數高于其它各組，各組間胚胎著床數兩兩對比差異均具有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組間行為學指標比較

注：與空白組對比，☆P<0.05；與模型組對比，★P<0.05；與陽性對照組對比，◇P<0.05

表2 各組見栓率與胚胎著床數比較

注：與空白組對比，☆P<0.05；與模型組對比，★P<0.05；與陽性對照組對比，◇P<0.05

3 各組子宮內膜VEGF、LIF表達水平比較 見表4。各組子宮內膜VEGF、LIF表達水平比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)；進一步兩兩對比，各組間子宮內膜VEGF、LIF表達水平差異均有統計學意義(P<0.05)。

表4 各組間LIF、VEGF對比(光度值)

注：與空白組對比，☆P<0.05；與模型組對比，★P<0.05；與陽性對照組對比，◇P<0.05

討 論

在生活節奏日益加快、各種壓力逐漸增強的現代社會中，女性的社會活動日益頻繁，承擔的壓力也更加多元化。長期處于這種應激狀態下，部分女性的生殖系統可發生不同程度的病理改變。在不孕癥的臨床上約有5%左右與精神應激因素相關，而在不孕癥女性患者中約有50%以上的患者合并有不同程度的心理癥狀[8-10]。外界的刺激、不孕癥形成的心理壓力使患者的神經內分泌、免疫功能以及生殖系統等發生應激反應。部分患者逐步形成生殖內分泌系統的慢性應激性損害。因此，慢性應激反應已經成為了生殖內分泌系列疾病的一種主要誘因。臨床主要表現為月經不調、婦科炎性疾病、復發性流產、不孕等諸多生殖障礙性病變，對患者的身心健康均構成不良影響[11-13]。現代西醫學認為，心理應激反應可誘發下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能亢進，使腎上腺皮質激素的分泌異常升高，抑制了β-內啡肽、下丘腦多巴胺以及5-羥色胺等的合成，使血清中泌乳素的含量升高，從而對卵巢甾體激素的分泌合成形成干擾，最終形成了生殖功能障礙[14-15]。ER是子宮內膜在正常月經周期中的特定的一段極短時間內允許胚胎侵入、黏附以及著床的開放功能，這一段極短時間為“著床期”、“窗口期”。胞飲突、同源框基因(Homeoboxgene，HOX)表達、局部激素分泌異常、細胞因子表達改變、免疫功能異常以及應激反應等均可對ER構成影響。

中醫學理論認為情志異常而形成的生殖系統病變或功能障礙等均屬于“肝郁”、“情志失調”等范疇。中醫理論認為本病蓋因肝郁不舒加之脾腎羸弱或后天失養，或有情志失調、飲食不節等而致的肝郁、腎虧、脾弱、血虛而形成本病。因此治療應以疏肝補腎、養血益氣、健脾固中為主。我們以疏肝補腎中藥對慢性應激小鼠進行治療效果理想。疏肝補腎方中菟絲子潤養肝腎、生精益血、通調經絡；柴胡、熟地、生白芍具有滋陰補血、疏肝健脾之功；柴胡入氣分、解郁疏肝、升陽；熟地溫潤柔肝，滋陰養血、益髓生精；白芍斂陰固津、柔肝養血；枸杞子平補精血、養腎柔肝；山萸肉溫養精氣、固澀榮血；當歸行血、補血；鹿角膠補益精血、溫陽補腎、榮筋強骨；制龜版涼血補心、潤燥養陰；仙靈脾調理沖任，可發揮理氣疏肝、補腎養陰之功；制香附味辛、微苦，性平，入肝經之氣分，可疏肝解郁，降逆泄火；鹿角霜溫補腎陽、止血固斂，主治脾腎陽虛、納差惡心、崩漏血瀝等癥；肉蓯蓉味甘、咸，可益腎補陽、潤腸通便，為補益陽精之要藥；白術健脾祛濕、補氣滋陰，利于水谷精微全身運化生血之功；雞內金味甘、性平，健胃補脾、消積化食，促進諸藥吸收。諸藥共用可益氣健脾、補腎疏肝、滋陰養血、條達氣機、充盈氣血之功。

通過本次研究證明，通過疏肝補腎中藥治療21 d后，觀察組小鼠的各項行為學指標優于陽性對照組與模型組，但與空白組的健康小鼠仍有一定差距，提示21d治療周期尚無法使慢性應激小鼠完全恢復至正常水平，通過延長治療有望達到正常標準。而陽性對照組小鼠的各項行為學指標優于模型組，說明逍遙丸能夠改善應激小鼠的行為學指標，但未能達到觀察組水平，提示疏肝補腎中藥對于改善應激小鼠行為學指標的效果較逍遙丸更為理想。觀察組的見栓率與胚胎著床率均高于模型組與陽性對照組，提示通過疏肝補腎中藥治療慢性應激小鼠的妊娠功能可達到甚至優于普通健康小鼠，說明疏肝補腎中藥具有明確的改善慢性應激小鼠子宮內膜容受性與妊娠能力的作用，且作用優于逍遙丸治療。

綜上所述，疏肝補腎中藥在改善慢性應激性小鼠子宮內膜容受性方面具有明確療效，能夠有效改善慢性應激模型小鼠子宮內膜VEGF及LIF表達水平從而改善子宮微環境，提高妊娠成功率。